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        细胞试验基本方法

        互联网

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        单核细胞的分离

        基本原理

        本文分离单核细胞所用方法是Percoll非连续性密度梯度离心法,主要是根据不同细胞间密度的差别进行细胞分离。此法易操作,且使用通常的实验设备即可完成。

        试剂与器材

        ·外周血单个核细胞(参见实验1)
          ·PBS1×和PBS10×(无Ca2+、Mg2+),含0.5mM EDTA
          ·胎牛血清(56℃,30分钟加热灭活)
          ·HCl1mol/l
          ·Percoll分层液(密度=1.130g/ml,商品)
          ·4g/l台盼蓝染液(溶解在PBS液中)
          ·50ml聚丙烯圆锥管
          ·毛细吸管
          ·移液管(1、2、10ml)
          ·CO2孵箱
          ·超净台
          ·有旋转桶转子装置的离心机
          ·PH计

        操作步骤

        所有的操作应该在无菌条件下进行

        (一)不同密度Percoll分层液的配制

        1.Percoll分层液储备液的制备:取未稀释的Percoll原液(从瓶中取)9ml+1ml PBS 10×(无Ca2+、Mg2+),用HCl1PH至7.4

        2. Percoll分层液(Ⅰ)(密度=1.080g/ml)的配制:取Percoll储备液3.12 ml(前一步配制)+1.88 ml PBS1×(无Ca2+、 Mg2+)

        3. Percoll分层液 (Ⅱ)(密度=1.069g/ml)的配制:取Percoll分层液(Ⅰ)2.68 ml+2.32ml PBS 1×(无Ca2+、Mg2+)

        4. Percoll分层液(Ⅲ)(密度=1.060g/ml)的配制:取Percoll分层液(Ⅱ)2.32 ml +2.68 ml PBS 1×(无Ca2+、Mg2+)

        (二)不连续密度梯度制备

        1. 将洗涤过的8×107外周血单个核细胞重新悬浮在2ml的Percoll分层液(Ⅰ)(密度=1.080g/ml)在这层液体的表面上轻轻铺上2ml Percoll分层液(Ⅱ)(密=1.069g/ml),后再于第二层液面上轻轻铺上2ml的Percoll分层液(Ⅲ)(密度=1.060g/ml)

        2. 20℃,在旋转转子中1000×g离心上步所形成的密度梯度90分钟(慢慢增加速度,无制动停转)。

        (三)单核细胞的分离

        1. 离心后单核细胞存在于Percoll分层液(Ⅱ)和(Ⅲ)(密度较小的部分)之间的界面中。

        2. 用毛细吸管仔细收集单核细胞。

        3. 用含1-5%胎牛血清的PBS 1×液洗涤细胞3次,4℃,400×g离心5分钟,弃上清液。

        4. 若需要进一步实验,将细胞重新悬浮于培养基中。

        5. 用台盼蓝拒染法测定细胞存活率。

        结果:本法回收的细胞中单核细胞占70-100%(存活率应大于90%),淋巴细胞占0-20%,粒细胞占0-5%,红细胞占0-7%,血小板小于0.5%。

        实验要点

        1.为了得到较好的结果,外周血单个核细胞分离后应立即使用。

        2.所有操作过程应在18-20℃中进行。

        3.仔细覆盖各种Percoll分层液,避免破坏其界面。

        4.洗涤分离细胞3次,以除去残存的Percoll分层液和血小板。

        5.如果所制备的细胞仍不纯,可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗体分子的磁珠, 以除去残存的NK、T、B淋巴细胞。

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