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基本方案2 PCR 产物限制性分析线粒体 DNA 点突变的筛查

相关实验：线粒体 DNA 突变缺失氧化磷酸化疾病的分子分析实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	粒细胞或骨骼肌基因组 DNA
试剂、试剂盒	亚精胺正反寡核苷酸引物 Taq DNA 聚合酶溴化二氨乙啡啶液琼脂糖胶 10XPCR扩增缓冲液 4dNTP 混合液 10 X 限制性缓冲液 6X 水溶性聚蔗糖凝胶加样缓冲液 DNA 分子质量标记 BSA 限制性内切核酸酶石蜡油 1 X TBE 缓冲液
仪器、耗材	热循环仪 UV Stratalinker

步骤

1. 使用下列试剂准备P C R 反应混合液（每次反应总体积48.75/jJ): 5pi 10 X P C R 扩增缓冲液； 8卩 I I.25mmol/L 4d N T P 混合物； I.5jlJ lOpmol/yl正寡核苷酸引物； I. lOpmol/^1反寡核苷酸引物； 32.75“ H 2O 0 紫外线（254n m ) 照射反应混合液5min。用于 < 2 0 个样本，对于 n+ l 个样本，准备充足的反应混合物（减去 T a g D N A 聚合酶），> 2 0 个样本时，准备 w+ 2 个样本的反应混合液。 2 . 加 Tag D N A 聚合酶（每次反应0 . 2 5 4 ) 至反应混合物，充分旋转混勻溶液，并且吸取 49^1混合物到被标记的0. 5 m l 离心管底部。将装有反应混合物的管子放在紫外线 ( 2 5 4 n m ) 下并照射240 000】（几秒钟）。 3. 加 25〜50ng粒细胞或骨骼肌的基因组D N A 或 5〜IOng血小板m t D N A 到每个管子中，也包括未含D N A 的空白对照。当检测血液样品时，同时分析同一个体中的白细胞和血小板 m t D N A 对于确定结果和筛选实验失误是有用的。检测结果在白细胞和血小板样品应协调。 4. 用 2 滴游离核酸酶石蜡油覆盖P C R 反应混合物并紧紧地盖上离心管的盖子。 5. 将样本放在热循环仪中并执行下列扩增的循环。 6 7 * 9 10 __________________________________ 第 9 章临床分子遗传学 . 429 • 起始步骤： 120s 94°C (加热） 3 0 个循环： . 60s 94°C (变性） 60s 退火和延伸（表 9. 8. 3) 最终步骤： 60s 72°C (延伸） 6. 分装10〜15jl J 的反应产物在琼脂糖胶中或agarose/NuSieve (F M C Bioprodiicts) gel, 以证实P C R 产生了大小合适的片段， P C R 的空白对照是没有反应产物的，也不会产生额外大小的条带，否则就妨碍限制性内切核酸酶结果的解释了。 7. 加 10. 0〜15. Oi ^l被扩增的m t D N A 片段到被标;i己的〇.5m l 离心管中。 8•加下列的试剂至管中（用于< 2 0 个样本，对于;2+ 1 个样本，准备充足的反应混合物，> 2 0 个样本时，准备n十2 个样本的反应混合液）： 2|ul适当的I O X 限制缓冲液（表 9. 8. 3); B S A 和亚精胺根据制造商的推荐；无菌去离子H 2O 20jul; 10U 被选择的限制性内切核酸酶（表 9. 8. 3)。选择适当的酶切温度孵育过夜（16〜20h) 9. 力 M m l 6X Ficoll上样缓冲液，振荡、点离。 10. 上样，电泳约3(^1 (总体积样品），并点D N A 标准品和阳性对照，以确定经酶切后 m t D N A 的大小。使用含约0. 05^g/ml E B 的 1X 7B E 来电泳。

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来源：丁香实验

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