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    整 体 培 养 中 同 型 转 换 重 排 的 PCR 检测

    相关实验：分子生物学实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

     

    基 本 方 案 1 通过转换接头的直接 PCR

    材 料（带 V 项 目 见 附 录 1)

    外周血分离的单核细胞（P B M C ; 单 元 8.1)

    I M D M -I O 完全培养基

    重组人 IL-4 (rfIL-4; 表 5. 0 •1)
    含 1 % 胎 牛 血 清 （56°C 灭 活 Ih) 的 P B S (F C S /P B S ) ，冰上预冷 抗 C D l 9 磁 珠 （Dynal) V P B S 10m m o l / L Tris • Cl (p H undefined 0) /10m m o l / L E D T A 1 0 % (W V r) S D S 3mo l / L 乙酸钠， p H 5.0 20m g /m l 蛋 白 酶 K (分装冻存于一20°C ) V 苯酚缓冲液 25 : I (V 7 V ) 氯仿/异戊醇 9 5 % 和 7 0 % 乙醇 V T E 缓冲液 2.5M mol/L 寡 核 苷 酸 引 物 （图 14.4.2A ; 溶 于 无 菌 水 ， 2.5pmol/ ^ ，一20°C 保 存 ） V 10X 直 接 P C R 扩増缓冲液 无菌水 矿物油 2. 5U Ta g D N A 聚合酶 V 预杂交溶液 P C R 扩增的32P 标 记 探 针 （见辅助方案） 2 X S S C /l % S D S /10m m o l / L E D T A 0 •I X S S C /l% S D S /10m m o l / L E D T A 15ml 的圆底离心管 Beckman J-6离心机和配有15m l 适配管的JS-4. 2 转 子 （或同等设备） 振荡器 稀有元素钴磁石〇• 6i n X 0. 6i n X 2. 5in 0.5m l 微量离心管，高压灭菌 滤 网 枪 头 （欧洲实验室） P C R 仪 Immobilon-N 或 P V D F 膜 65°C 振荡的水浴箱 1 . 外周血细胞以2 X 106个细胞/m l 的密度悬浮于I M D M -I O 完全培养基。实验组的培养 基中每毫升加入20U 人 重 组 IL- 4 , 而对照组的培养基中不加人重组IL-4。 其 中 F C S 的 用 量 很 大 程 度 上 影 响 了 Ig E 的 表 达 ， 所 以 建 议 先 按 浓 度 梯 度 进 行 实 验 。 2 . 每隔2411取251111细胞悬液（5 \ 1 0 7个），共 取 7 次 ；用101111预冷的？〇 3/1^3洗两 次 （将细胞悬液置于15m l 离心管中， 4°C ， I O O O g 离 心 5m i n )。每个时间点的细胞 都按步骤3〜6 处理。 转 换 重 组 在 第 三 天 可 以 检 测 到 ， 在 第 四 天 达 到 稳 定 。 3 . 用 5m l 预 冷 的 F C S /P B S 悬浮细胞沉淀于15m l 离心管中，记数活细胞，以每个 B 细 胞 加 3 个磁珠的比例加入抗C D 1 9 磁 珠 （假 定 B 细胞大约占所有淋巴细胞的1 0 % ) 。
    A 人SpSs转换区直接PCR引物 转换区扩增 幼 a I 5 'S 从 ggccTCTAGACAAGGGGACCTGCTCATTTTTATC Mills等(1990)描述的Sja的1〜30位核苷酸序列 E c o R I 3 ’ SE qqccqaattcAGTGCGGTCTGTACAGCGTGGC Ueda等(1982)描述的郎的527〜5〇 8位核苷酸序列 人 端 316bp探针的扩增 BamHI N P S-A R ggccggatccGCACAG GCTCCTAAATTCTTGG Mills等(1990)描述的郎的34〜55位核苷酸序列 F l 4 AGTTTAGCCATCTGAGTCCATTTCT Mills等(1990)描述的郎的3仍〜325位核苷酸序列 B 鼠S| ii-SY1转换区DCPCR引物 转换区扩增 Sail C PA5M -B ggccqqtcqacG GAGACCAATAATCAGAGG G AAG 五 wRI的3'端Sji上游94bp的MUSIGCD07核苷酸的3680〜3658位 C IaI C P A 3 G 1 -A g c g c c a t c g a t g GAGAGCAGGGTCTCCTGGGTAGG 及^RI的5'端Syl下游51bp的MUSIGHANB核苷酸的8893〜8915位 鼠尼古丁乙酰胆碱受体基因M cM ，参见该对照描述的注解) Sail n A C h R -B ggccqqtcqacAG G CG CG CACTG ACACCACTAAG MUSACHRBB核苷酸的5994〜5972位 C IaI nA C h R -A qcqccatccratGGACTGCTGTGGGTTTCACCCAG MUSACHRBB核苷酸的9545〜9567位 图 1 4 . 4 . 2 寡核苷酸引物。大写字母为基因组D N A 序列衍生的核苷酸，小写字母为外加的核苷 酸，目的是提供酶切位点。 5'Sjll和 寡 核 苷 酸 为 研 究 人 " 转 换 的 PCR引物。 探针 用于杂交M-e转换模板的P C R 扩增产物。 CPA5M -B 和 CAP3G1- A 用 于 PCR 检测小鼠SjLt -Syl转 换。 nAChR-B和 nAChR-A引物用于扩增尼古丁乙酰胆碱受体的DCPCR产 物 （作 为 DCPCR反应 重基因组D N A 消化和环化对照）。所有的引物根据GenBank中的D N A序列设计。 然 后 再 冰 浴 30min; 其 中 每 隔 5m i n 就 用 振 荡 器 轻 柔 振 荡 使 细 胞 和 磁 珠 均 匀 悬 浮 于 PBS 中 。 4 . 将 离 心 管 置 于 两 块 钴 磁 石 间 2min ，弃 去 F C S /P B S ，分 离 B 细 胞 。重 悬 细 胞 ，磁 石 分 选 ，至 少 重 复 3 次 以 上 。 5• 最 后 一 次 F C S /P B S 洗 细 胞 后 ， 5m l P B S 悬 浮 细 胞 和 吸 附 的 磁 珠 ， IOOOg•离心5min。 6 . 弃 上 清 ，用 I. 58ml 10mmol/L Tris •Cl (p H 8. 0) /10mmol/L E D T A 重 悬 细 胞 ，将
    悬 液 置 于 15m l 圆 底 离 心 管 中 。并 加 入 200M 1 10% S D S [ 终 浓 度 1 % (m /V ) ] 和 200/xl3mol/L p H 5 . 0 乙 酸 钠 轻 轻 地 混 匀 ，使 细 胞 充 分 裂 解 。然 后 将 样 品 冻 存 于 一20°C 中直至所有的样品都处理好。 7 . 融化冻存的样品，加入 2(^110m g /m l 的蛋白酶K ， 37°C 中孵育5h 消化样品中的蛋白质。 8. 2m l 苯酚缓冲液提取D N A —次 ，室温， 1200g 离 心 5m i n ; 将 水 相 移 入 新 的 15m l 离 心管中， 2m l 2 5 : l 的氯仿/异戊醇抽提，再次室温， 1200g 离 心 5m i n ; 随后又将水 相移入新的15m l 离心管中，加 入 5ml 9 5 % 的乙醇。颠倒混 匀 ，室 温 放 置 I O m i n 使 D N A 沉淀。 9 . 室温， 1200^离 心 l O m i n，弃上清，用 7 0 % 的乙醇重悬；再 离 心 5m i n ，弃上清，用 7 0 % 的乙醇重复洗一遍，在空气中风干沉淀。 10. 加 入 50M 1的 T E 缓冲 液 ， 4°C 孵 育 过 夜 溶 解 D N A 。取 2/^1样品用荧光比色法测定 D N A 的浓度。 5 X 107个 细 胞 一 般 能 得 到 5〜 20|u g D N A 。 11. 在 0.5m l 的微量离心管中加入扩增所需物质（总体积25M 1)，用滤网枪头转移溶液： 0. 5M 1的淋巴细胞D N A 各 I.0M1 2. 5M mo l/L 的上下游寡核苷酸引物（终浓度为0. lM m o l/L ) 2. 5M1 I O X P C R 扩增缓冲液 无菌水补到25/xl。 表面覆盖一滴矿物油（约 5〇 W )。 12. 将 离 心 管 置 于 P C R 仪 上 95°C 反 应 l m i n ，然 后 冷 却 到 80°C ，再 在 各 管 中 加 入 Ipl (2. 5U ) T a g D N A 聚合酶。 1 3 . 根据以下程序在P C R 仪中进行反应： 2 个循环： Imin 95〇C 变性 I.5min 58〇C 复性 6min 72〇C 延伸 4 0 个循环： Imin 95〇C 变性 I.5min 63〇C 复性 6min 72〇C 延伸 1 4 . 取 8/^1的 P C R 产物进行琼脂糖电泳（琼脂糖浓度为0 . 7 % ， T B E 电泳缓冲液）。 1 5 . 通过毛细管印迹法将胶上的D N A 转 移 到 Immobilon-N膜上。 也 可 以 用 嵌 套 式 引 物 再 次 扩 增 ，最 后 产 物 琼 脂 糖 电 泳 。 16. 置小心预湿的Immobilon-N 膜 和 I O m l 预 杂 交 溶 液 （每 150c m 2膜）在密封塑料袋 中， 65°C 预 杂 交 5〜24h 。 17. 塑料袋开一小口，加入32P 标记的变性探针，再次密封塑料袋，彻底混匀，然后在 65°C 振荡的水浴中杂交8〜16h 。 18. 分别用以下液体洗膜3 次 ： 室温 2 X S S C /l% S D S /10m m o l / L E D T A 振荡 5tnin 室温 2 X S S C /l % S D S /10m m o l / L E D T A 振荡 15min 65〇C 0 •l X S S C /l % S D S /10m m o l / L E D T A 振荡 15m i n 。
    19.用增感屏在一80°C 放射显影5h 。如果需要可延长显影时间重新曝光。 辅 助 方 案 通 过 P C R 和随机引物标记法制备S7Sji探针 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) p X E 质 粒 （Mills衫W .， 1990;可从作者处获得）或人类基因组D N A 2.5ymol/L 寡核苷酸引物N P S -A R 和 F 14 (图 14.4.2A ; 无 菌 水 配 成 2.5pmol//xl， 一20°C 保存） V 10 X 直 接 P C R 扩增缓冲液 2. 5U T a g D N A 聚合酶 矿物油 沸水浴 1 . 在 0.5m l 微量离心管中，加入下列扩增混合物（总 体 积 25ptl): IOng p X E 质粒 2, 5M m o l / L 的 N P S - A R 和 F 14 引物各 1/xl (终浓度为 0 •lM m o l/L ) 2. 5/xl 10X 直 接 P C R 扩增缓冲液 1/xl (2. 5U ) Ta g D N A 聚合酶 加水至总体积25M1 在混合物上覆盖一滴矿物油（50m 1)。 人 类 基 因 组 D N A 需 要 更 多 D N A 模 板 和 扩 增 循 环 数 。 2 . 扩增程序： 4 0 个循环： Imin 95 °C I.5min 55〇 C 3min 74〇 C 3 . 在低熔点琼脂糖中纯化P C R 扩增产物，并且通过琼脂糖电泳或荧光比色法检查纯度 和产量。 4 . 用随机寡核苷酸引物合成法同位素标记50〜 I O O n g 扩增片段。 3m i n 沸水浴使探针 变性。 探针长度为316b p ，位 于 5S / X 引物和Sju pentameric重复区之间。 基本方案2 消化-环化P C R 限制酶消化小鼠B 淋巴细胞的基因组D N A ，所切的基因片段位点包含环化和扩增 的 目 的 转 换 区 （图 14.4.3)。为了从P C R 产物得到起始重组基因的模板数量，以下两个 对照是必需的：一个是消化和环化效率对照，另一个是P C R 各管之间的效率差异对照。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 小 鼠 脾 脏 （附 录 2H ) V R P M I - 5 完 全 培 养 基 （其中含有l U / m l 青霉 素 和 l^ g/ml链霉素) 4m g / m l 大肠杆菌LPS
    图 14.4.3 DCPCR检 测 Sjit-Syl转化重组。顶 排 为 u -e转换重组涉及的小鼠免疫球蛋白框架： 装 配 好 的VDJ区 ，两 个 恒 定 区 （Qx-Cyl) ，两 个 转 换 区 （Sju-Syl)， 4 个 EcoRI酶切位点。寡 核 苷 酸 a 和寡核苷酸b 的位置分别对应图14. 2, 2 中 CPA5M-B 和 CAP3G1-A 。转换再结合去 掉了点线之间的DNA序列，形成了第二行中的结构（“转 换 DNA”）。第三行描述了 DCPCR 的中间步骤：带 有 S/ x -Syl转换区的线性片段和DCPCR引 物 a 和 b 扩增的靶序列； EcoRI酶 切后的连接片段的环化；引 物 a 和 b 得 到 的 PCR产 物 。 小鼠重组1乙-4(表5.0.1)，无菌 J^ 0R I 限制性内切核酸酶和I O X ^ 0R I 缓冲液 ^/400U /iu l T 4 D N A 连接酶和10X 连 接 酶 缓 冲 液 （附 录 l) V 1〇 X D C P C R 扩增缓冲液 2.5M mol/L 寡 核 苷 酸 引 物 （图 14.4.2B ; 溶 于 无 菌 水 至 2.5p m 〇l/W ，一20°C 保 存 ） 2. 5U Tag D N A 聚合酶 无菌水 经过修饰的spiking质 粒 （可选，可由作者处获得） 10mCi/ m l [a-32P ] 标记的 d C T P (3000Ci/m m o l ) 矿物油 37°C ， 6 % C O 2增湿箱 70°C 和 16°C 水浴 1.5m l 和 0.5m l 微量离心管，高压灭菌 滤 网 枪 头 （欧洲实验室） P C R 仪 1 . 从小鼠脾脏制备淋巴细胞悬液。用 T 细胞特异性表面抗原的抗体去除T 细胞和补体 (C P I 单 元 3. 4)，通 过 不 连 续 Percoll密 度 梯 度 离 心 法 获 得 静 息 期 的 B 细 胞 （单元 2. 5)，取 6 6 % 〜7 0 % 片段。 1 0 个 脾 脏 产 生 IO8个 细 胞 。 2 . 在 R P M I - 5 完全培养基中培养B 细 胞 ，初 始 浓 度 I X l O 5〜 2 X 105个细胞/m l 。 加入 LPS (终 浓 度 20/xg/ml) 和 IL-4 (终 浓 度 10 000U /ml) 放置于培养箱中，并定期换 液 （如 2. 5〜4 天）
    加 入 L P S 至终浓度之后需将培养基进行过滤除菌，经过过滤除菌后加入IL-4。 3 . 制 备 基 因 组 D N A ，并通过荧光比色或紫外分光光度法在280n m 和 260n m 处测定 D N A 浓度。 T E 缓冲液调节浓度至20M g/m l 。 4. 1.5m l 微量离心管配制酶切反应体系： 2M g 基 因组 D N A (从 步 骤 3 开始） 10M 1 10 X EcoRI 缓冲液 5U EcoRI 加 水 至 lOO/ xl。 37C 孵 育 6〜8h 或者过夜， 70°C孵 育 20miri灭活限制酶活性。 5 . 在另一 1.5m l 微量离心管中配制连接反应体系（终 体 积 100M 1): 9iul£： a )R I 消 化 混 合 物 （步 骤 4 的酶切产物； D N A 终 浓 度 I.8iug/m l ) 10M1 I O X 连 接 缓 冲 液 （终 浓 度 I X ) 2/xl T 4 D N A 连 接 酶 （终 浓 度 800U ) 79/xl 水 16°C 孵育过夜。 6 . 将 0.5m l 离心管放于冰上，配 制 扩 增 体 系 （共 20M1): 用滤网枪头转移溶液 3M 1 连 接 混 合 物 （步 骤 5 的连接产物；约 5n g D N A ) 2/xl 10X D C P C R 扩增缓冲液 2. 5p m o l / V 寡核苷酸引物各4/xl (终浓 度 0. 5|u m 〇l/L ) 1M1 2. 5U/iul Tag D N A 聚 合 酶 （终浓度 2. 5U ) 6卜1水 表面覆盖一滴矿物油（约5〇 4)。 如果要定量P C R 反 应 ，在扩增体系中加入下列试剂：① Ijul修 饰 过 的 spiking 质粒，稀 释 到 10〜2000个分子/jul. ，② lOmCi/ml O -32P ] 标 记 的 d C T P 0.5/xl (特 异活性 3000Ci/m m o l )。 7 . 扩增步骤 I 个循环： 6min 94〇 C 预变性 5 个循环： Imin 94〇 C 变性 Imin 65〇 C 复性 2min 72 °C 延伸 3 0 个循环： Imin 94〇 C 变性 Imin 68〇 C 复性 2min 72°C 延伸 1 个循环： 7min 72〇 C 延伸 8 . 用非变性聚丙烯酰胺电泳法分析P C R 扩增产物

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    来源：丁香实验

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