整体培养中同型转换重排的 PCR 检测

基本方案 1 通过转换接头的直接 PCR

材料（带 V 项目见附录 1)

外周血分离的单核细胞（P B M C ; 单元 8.1)

I M D M -I O 完全培养基

重组人 IL-4 (rfIL-4; 表 5. 0 •1)
$含 1 % 胎牛血清（56°C 灭活 Ih) 的 P B S (F C S /P B S ) ，冰上预冷抗 C D l 9 磁珠（Dynal) V P B S 10m m o l / L Tris • Cl (p H undefined 0) /10m m o l / L E D T A 1 0 % (W V r) S D S 3mo l / L 乙酸钠， p H 5.0 20m g /m l 蛋白酶 K (分装冻存于一20°C ) V 苯酚缓冲液 25 : I (V 7 V ) 氯仿/异戊醇 9 5 % 和 7 0 % 乙醇 V T E 缓冲液 2.5M mol/L 寡核苷酸引物（图 14.4.2A ; 溶于无菌水， 2.5pmol/ ^ ，一20°C 保存） V 10X 直接 P C R 扩増缓冲液无菌水矿物油 2. 5U Ta g D N A 聚合酶 V 预杂交溶液 P C R 扩增的32P 标记探针（见辅助方案） 2 X S S C /l % S D S /10m m o l / L E D T A 0 •I X S S C /l% S D S /10m m o l / L E D T A 15ml 的圆底离心管 Beckman J-6离心机和配有15m l 适配管的JS-4. 2 转子（或同等设备）振荡器稀有元素钴磁石〇• 6i n X 0. 6i n X 2. 5in 0.5m l 微量离心管，高压灭菌滤网枪头（欧洲实验室） P C R 仪 Immobilon-N 或 P V D F 膜 65°C 振荡的水浴箱 1 . 外周血细胞以2 X 106个细胞/m l 的密度悬浮于I M D M -I O 完全培养基。实验组的培养基中每毫升加入20U 人重组 IL- 4 , 而对照组的培养基中不加人重组IL-4。其中 F C S 的用量很大程度上影响了 Ig E 的表达，所以建议先按浓度梯度进行实验。 2 . 每隔2411取251111细胞悬液（5 \ 1 0 7个），共取 7 次；用101111预冷的？〇 3/1^3洗两次（将细胞悬液置于15m l 离心管中， 4°C ， I O O O g 离心 5m i n )。每个时间点的细胞都按步骤3〜6 处理。转换重组在第三天可以检测到，在第四天达到稳定。 3 . 用 5m l 预冷的 F C S /P B S 悬浮细胞沉淀于15m l 离心管中，记数活细胞，以每个 B 细胞加 3 个磁珠的比例加入抗C D 1 9 磁珠（假定 B 细胞大约占所有淋巴细胞的1 0 % ) 。$