方案6 亚秒级光交联：用水溶性金属复合体监控蛋白质-蛋白质相互作用实验

一、用 Pd（Ⅱ）金属化 TMPyP

1.将 1mg (1.2umol) 的 TMPyP 溶于 1.4 ml 水中，然后加入 0.34 mg(1.9umol) 的 PdCl2, 加热至 95°C 反应 2 h。

实验提示：在金属化过程中，4 个 Q 带峰值 518nm、554nm、584nm 和 639nm，会变为 525nm 和 558nm 的两个峰，因此可以用可见分光光度计来监控金属化过程。

2.冷却样品，并用孔径为 45um 的注射过滤器过滤，加入 TFA 至终浓度为 1%。

3.将溶液注入用 1%TFA 平衡好的 SepPakC18 容器中，用 5 ml1% 的 TFA 冲洗容器。

4.用 0.5 ml 的甲醇，将 TMPyP-PcKII) 洗脱到一预先称重的小离心管中。

5.甲醇蒸发后，将 TMPyP-Pd(II) 溶于 1ml 水中，在 417nm 处 [e=158X10³L/(mol·cm)] 测出其浓度。

该试剂可在冷冻避光条件下无限期保存。

二、光交联蛋白质

警告：在使用氙灯光交联装置时，须戴安全的有色眼镜以保护眼睛。

1.在 1.7 ml 的小离心管内准备总反应体积为 20W 的蛋白样品，其中含有蛋白质、1 X 反应缓冲液和 125umol/L 的 TMPyP-Pd(II)，避光反应。

2.在光裂解反应之前，加人 5ul 新鲜配制的过硫酸铵。确保样品管在样品支架上呈水平状态（即与光束平行）。

3.将 SLP 相机与光源间的挡板移开，控制快门的开启时间为0.5s，此处可以使用相机的自动计时器。在关上快门后，将相机与光源之间的挡板重新装上。

4.迅速加入 7 ul 4 X 上样缓冲液，以终止反应。

5.SDS-PAGE 电泳后，考马斯亮蓝染色或 Western 印迹，对反应产物进行分析。

图 10.26 显示的是一个典型的交联反应实验结果。在这个实验中，用上述方法使 UvsY 发生交联反应。可以从第六列看到：只有在金属复合物和过硫酸铵均存在的情况下，闪烁曝光光裂解交联反应才得以发生。同时可以看到的是：在第三列上，在未加人过硫酸铵的情况下长期曝光，可发生氧分子介导的交联反应。