方案1 用 FLAG抗原表位标记蛋白质进行蛋白质免疫共沉淀

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

试剂、试剂盒	RF10培养基 IEF缓冲液甘氨酸裂解缓冲液 RPMI 1640 培养基抗 FLAGM2 琼脂糖亲和凝胶聚乙烯亚胺 4 X SDS-PAGE 加样缓冲液辣根过氧化物酶 NaCl 磷酸盐缓冲液叠氮化钠胰岛素
仪器、耗材	配有检测 GFP 滤片的荧光显微镜微量离心管多预装层析柱 SDS-PAGE 和 2D-IPG SDS-PAGE 仪器超滤柱微型离心机培养箱针头大型离心机摇床

步骤

一、用于小范围分析的代谢标记

在蛋白质相互作用的初步分析中，可以用代谢标记检测免疫共沉淀的蛋白质。 ⑨ 转染一天后，除去培养基，加 3m l新鲜的含有 [35S ] M et [终浓度为1.85X 106Bq/m l.(0. 05mCi/m l) ] 的 RFlO 培养基。 ⑩ 重新放置到培养箱中，培养 16h。用这么长的标记时间，是考虑到了转换率不局的蛋白质的标记。可选择••虽然一些细胞在没有未标记的M et的 R FlO 培养基中时间太长会生长不良，但在这种情况下可获得更高水平的结合。

二、细胞裂解

转染 48h 后，用 IOml P B S 冲洗细胞两次。警告：要确定已适当地除去了放射性废物。 ⑫ 弃掉所有的 PBS，每个 IO cm 平板加 Im l ( 或 3m l/15c m 板）冰冷的细胞裂解缓冲液（用时现加人蛋白酶抑制剂）。 ⑬ 用细胞刮刀，将细胞从培养板上刮下来，将细胞裂解液移到微量离心管中。 ⑭ 细胞裂解液置于4°C 摇床中 lh ，进一步裂解。 ⑮ 4°C 、 1 3 0 0 ( ^ 离心 IO m in，除去核和细胞碎片，取上清置冰上。

三、用于小范围分析的免疫共沉淀

四、用抗体层析柱大规模富集 FLAG 标记的蛋白质以及与它相互作用的蛋白质

接加叠氮化钠（终浓度 0 . 1 % ，体积比）到柱床里的P B S 中，封上柱子， 4°C 保存，供以后使用。 @ 将上述收集的20沁样品（ S I 〜S8)，用抗 FLAG M 2 单克隆抗体和辣根过氧化物酶（ H R P ) 标记的抗鼠的二抗，做 Western blot分析。层析柱从细胞裂解液中除去FLA G -蛋白 X 的效率，可通过在 S 2 中保留多少 FLA G -蛋白 X 与起始物S l 中的比确定。 ⑯ 从洗脱组分 S 3〜S 8 中，合并能用 W estern b l o t检测到的 FL A G -蛋白 X 的组分。

五、用于纯化的蛋白质浓缩

将含有FLA G -蛋白 X 的组分合并，放入一个超滤离心管中，根据供应商提供的说明书，进行浓缩。实验提示：一个 C entricon-IO 的超滤离心管的截留分子量是10000，如果免疫共沉淀的蛋白质（即与蛋白X 相互作用的蛋白质）的分子质量超过I O k D a ,上述超滤离心管就适用。其他 C en trico n离心管应用于更小的蛋白。 ⑪ 当全部的合并成分，浓缩到很小的体积时（如 50jul) , 倒置 C en trico n离心管，根据供应商的说明书，浓缩回收物。 ⑫ 用 I E F 缓冲液1 : 4 稀释样品。实验技巧：有些蛋白质可能会结合到Centricon离心管的超滤膜上，用 I E F 缓冲液可以把它们洗下来。