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        方案6 羧基端序列分析实验

        相关实验:蛋白质氨基端及羧基端序列分析实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、将蛋白质转移到 PVDF 膜上

        步骤1 利用电印迹法或从溶液中直接吸收(利用 ProSorb 样品制备容器),向 PVDF 膜转移 50?IOOpmol 的蛋白质样品。具体如下。

        对于蛋白质电印迹到 PVDF 膜:

        1.将凝胶中分离的蛋白质电转移到一张 PVDF 膜上(见方案 2 和 Mozdzanowski,et al,1992)。

        2.用考马斯亮蓝 R250(见方案 3) 浸染含有目的蛋白的 PVDF 膜。将膜在空气中晾干。

        实验提示:可以用两张纸夹住膜,挂在化学容器中或直接在工作台上干燥,不过要在膜上盖一张滤纸以防止污染。

        3.切下目的蛋白条带或点

        如果不是立即进行分析,条带/点可以在 -20°C 下保存几个月。

        4.如果需要同时进行氨基端序列分析和羧基端序列分析,那么进行步骤2,对固定在 PVDF 膜上的样品进行氨基端测序;如果只需做羧基端测序,那么将结合在膜上的蛋白点放入 1.5 ml 微量离心管,进行步骤3。

        对于将溶液中的蛋白吸附到 PVDF 膜(ProSorb):

        1.用 5ul 的甲醇润湿 PVDF 膜。

        2.向样品贮存器中加入 100ul 0.5% 的 TFA。

        3.向样品贮存器中加入 5~800ul 蛋白质样品缓冲液。

        4.如果样品缓冲液中含有盐分或其他低分子量杂质,用 100ul 0.1% 的 TFA 洗膜,洗 2 遍以上。

        5.将内有 PVDF 膜的样品贮存器嵌入到一个培养皿中,确保结合蛋白质的膜面朝上。

        6.用一个玻璃烧杯罩住嵌入的膜(在贮存器中),将培养皿置于设为 60°C 的加热块上。完全干燥 PVDF 膜(约 20 min)。

        目的是在 PVFD 膜干燥的过程中避免接触空气中的污染物,也避免烧杯接触到膜。

        7.小心地取出 PVDF 膜。

        8.如果需要同时进行氨基端序列分析和羧基端序列分析,那么进行步骤②,对固定在 PVDF 膜上的样品进行氨基端测序;如果只需做羧基端测序,那么将结合在膜上的蛋白点放入 1.5 ml 微量离心管,进行步骤③。

        二、氨基酸测序

        步骤2 依次进行氨基端和羧基端测序:

        1.以 5~25 个循环进行氨基端序列分析。

        2.将膜放入 1.5 ml 微量离心管,进行步骤③。

        步骤3 准备羧基端测序的样品:

        1.向 PVDF 胰加人『1: 溶于庚 5%DIEA, 使庚練在 6(TC 蒸发约 Imin0

        2.加人 5ul 溶于乙腈的 1% PIC,60℃ 温育 5 min。

        3.将带有 PIC-衍生样品的 PVDF 膜转移到羧基端测序仪器中的反应器内。
        方案6 羧基端序列分析实验
        方案6 羧基端序列分析实验
        方案6 羧基端序列分析实验

        来源:丁香实验

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