蛋白质氨基端及羧基端序列分析实验

一、浸润层析柱 1.将准备好的两相柱的亲水段（凸向接头）移开，放在一边。 2.将柱的疏水段（凹向接头）和上样漏斗装配在一起。 3.向下按压上样漏斗并且顺时针旋转，将上样漏斗和柱的疏水段装人样品上样室中。 4.将 1ml HPLC 级的甲醇充满上样漏斗。 5.旋紧上样器的螺旋盖。 6.打开氮气（80psi) 维持足够时间，使上样漏斗变空，但应

要点：为了避免凝胶或膜的蛋白质污染，进行以下操作时需戴手套。 1.凝胶电泳之后，立即将凝胶转移到一个塑料容器中。 凝胶在电印迹之前不能进行染色，因为接触甲醇/乙酸会使蛋白质固定在聚丙烯酰胺凝胶上，会大大降低从凝胶电转移到膜上的蛋白量。 2.加入足以浸没凝胶的转移缓冲液，在室温放置 5~lOmin。 3.根据凝胶大小剪一块 PVDF 膜，用 10

1.依方案2 电转移后，将 PVDF膜迅速放于塑料容器中，并加人考马斯亮蓝染色液浸没膜。室温下染 5〜10 min 。 2.弃去染色液，加人脱色液浸没膜，在 PVDF 膜完全脱色后换液。大约共需换 3〜4 次脱色液，共脱色 30min 到 1 h 。 3.用水洗 PVDF 膜约 5〜10 min 。 4.重复洗膜 5 次以上。 ​

1.切下二维凝胶目的蛋白点，每个点分别放置于 10 ml 的聚丙烯管，用 9 ml 水重新水化。 注意不要将这些蛋白点搞混。从不同的凝胶上获得的相同的蛋白点可以在一个聚丙烯管中处理。 2.用 9 ml 水洗涤重新水化的胶块，共洗 5 次，每一次约 5 min。 3.弃去最后一次洗涤的水，加人平衡缓冲液以浸没胶块，室温下平衡胶块 lh。 4.向巴

1.将放射性标记的肽段在小试管中溶解于 20ul 适当的溶剂中（如含或不含 0.1%TFA 的 30% 乙腈水溶液，可能会将多肽从 RP-HPLC 柱上洗脱下来）。加热混合物至 55°C，直至溶解。 2.用契仑科夫法在闪烁计数器中计数（注音：契仑科夫计数时不加闪烁液）。 3.将 Sequelon-AA 盘从试剂盒中取出，放置于 55°C 的聚醋薄膜上。 4.滴加放

一、将蛋白质转移到 PVDF 膜上 步骤1 利用电印迹法或从溶液中直接吸收（利用 ProSorb 样品制备容器），向 PVDF 膜转移 50?IOOpmol 的蛋白质样品。具体如下。 对于蛋白质电印迹到 PVDF 膜： 1.将凝胶中分离的蛋白质电转移到一张 PVDF 膜上（见方案 2 和 Mozdzanowski,et al,1992)。 2.用考马斯亮蓝