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        方案15 双向凝胶的槽式转移实验

        相关实验:固相化 pH 梯度双向凝胶电泳实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1.测量 SDS-PAGE 凝胶的尺寸,将转移膜剪成与凝胶相适应的尺寸。

        槽式转移系统的膜根据需要可以剪成比凝胶大或者小。

        2.用水将薄膜润湿或用甲醇将 PVDF 膜润湿。操作要小心,以避免膜不平整及膜下面产生气泡。

        3.将湿润的薄膜转移到一个盛有转移缓冲液的平皿中,使膜在其中平衡 5 min。

        4.将印迹纸剪切成合适大小,按照转移设备的指导手册进行操作。

        5.将印迹纸、凝胶和膜排列成「三明治」状,避免在任何层之间产生气泡。这是很关键的,因为气泡可阻止相关位置蛋白质的转移。最好按以下(1)~(8)的说明进行操作:

        (1)将转移盒放人盛有转移缓冲液的平皿中。

        (2)将泡沫海绵放在转移盒里,挤压走所有气泡。

        (3)将印迹纸的一层放在海绵的上面,以保证其完全湿润和平整;在印迹纸上来回滚动玻璃棒以赶走气泡。

        (4)将双向凝胶放在印迹纸表面,排列整齐,通过滚动的玻璃棒赶走所有的气泡,但要小心不要在凝胶上施加太多的压力。

        (5)将转移膜放在凝胶上方,注意一开始应将膜放在准确的位置,在凝胶上移动膜通可能引起污迹;用滚动的玻璃棒去除膜与凝胶之间的气泡。

        (6)将另外一张印迹纸放在膜上,确保它湿润、平整;通过滚动玻璃棒去除印迹纸表面的气泡。

        (7)将泡沫海绵放在转移盒中,挤压走海绵中的气泡。

        (8)盖上转移盒的盖子。

        6.对其他每块要进行电泳转移的凝胶重复步骤5。

        7.在转移盒中装人 2/3 体积的转移缓冲液。

        8.将转移盒放入转移槽中。

        实验提示:确保线路连接正确以便使蛋白质从凝胶转移到膜上,而不是从凝胶到印迹纸,最后到溶液中。

        9.在转移单元中加转移缓冲液以确保所有的转移盒浸没在缓冲液中。

        10.将盖子放在转移槽上,使正极(红)接近于膜而不是凝胶。

        使在电泳期间,使凝胶上的蛋白质从负极(黑)迁移到正极(红)。

        11.如果转移进行 lh,将循环水浴和热交换系统相连,温度设置在 15°C。

        这种转移设备在高电流条件下使用,如没有有效的冷却设备,将会损坏转移设备。循环水浴将能保持转移过程中的温度。

        12.按照操作指导手册建议的时间和电流进行转移。

        13.当完成转移时,停止水浴,关掉电源。打开盖子,移出转移盒。

        14.卸下转移盒里的海绵、印迹纸、膜、凝胶。用去离子水洗净海绵,在空气中瞭干以备下一次使用。用软铅笔来标记对着凝胶的膜面的一边。

        不要用钢笔或记号笔,因为墨水会溶解在浸膜所用的缓冲液中。

        15.对膜进行染色或处理印迹(参见方案 17~20),或将膜置于印迹纸之间,于黑暗处干燥保存。

        如果干燥保存,在染色之前,必须用水(硝酸纤维素薄膜)或甲醇 (PVDF 膜)重新湿润。

        来源:丁香实验

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