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        方案3 双向凝胶电泳大肠杆菌裂解液的制备实验

        相关实验:固相化 pH 梯度双向凝胶电泳实验

        最新修订时间:

        原理

        细菌裂解液含大量核酸,在进行双向凝胶电泳之前,需先对核酸进行处理。可通过超声波处理包含脲和 CHAPS 的细菌提取液。当脲存在时,核酸酶(Benzonase) 是有活性的,但是其活性依赖于 Mg2+。核酸酶处理后加入 EDTA 以抑制金属蛋白酶活性。

        材料与仪器

        步骤

        1.将培养基装人质量已知的瓶子或管子中,12000 g、4°C 离心 5 min,以沉淀大肠杆菌。

        2.弃去上层清液,完全吸干离心管。称量瓶子或管子的毛重,去除皮重以确定大肠杆菌的重量。

        3.在冷抽提液中重悬沉淀,每 1g 细胞用 1Oml 抽提液。将细胞悬液转移到塑料圆锥形离心管中。每 1Oml 抽提液加 1 ul (500U)Benzonase 和 100ul 100 mmol/L PMSF。每加人一次液体之后都要上下颠倒混匀。将试管放在盛有冰的烧杯内。

        4.在细胞悬液中,用超声波处理细胞。将超声波仪的输出功率设定为最大值。每 15s 进行一次超声处理,每次超声处理之后冷却细胞悬液,重复多次直到细胞悬液清澈。

        5.每 1Oml 提取液中加0.5 ml 1.2mol/L DTT,颠倒混匀,将试管在冰上放置 15 min。

        6.每 1Oml 提取液中加 100 ul 200 mmol/L Na2EDTA, 颠倒混勾。

        7.将裂解液转移到离心管中,20000 g、4°C 离心 15 min。

        8.测定上清液中的蛋白质浓度。

        9.将上清液分成若干份,每 lOOul 为 1 等份。如果不立即用于 IEF,将其储存在-80°C,避免多次反复冻融造成的副作用。

        10.依方案 5 的步骤来完成第一向 IEF。对于第一向 IEF,蛋白质浓度应为 5~10 mg/ml。样品可用水化液稀释到准确浓度。

        来源:丁香实验

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