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        方案12 与质谱兼容的银染法实验

        相关实验:固相化 pH 梯度双向凝胶电泳实验

        最新修订时间:

        原理

        在方案 11 中介绍的银氨方法是用于检测在 SDS-PAGE 凝胶上蛋白质的最灵敏的方法之一。但是,这种方法和其他标准银染方法都不适合于质谱分析,而质谱已成为鉴定双向凝胶上蛋白质的最好方法。因为在凝胶中被质谱分析的蛋白质不能被修饰,许多通常用的敏化试剂(例如戊二醛和强氧化剂)不能使用。而且,研究者发现购买专用试剂盒有很多优点,因为其中的试剂质量对完成银染是有保证的。这样的试剂盒可从不同公司购得,如 Amersham Biosciences、Bio-Rad、Piece 等化学试剂供应公司。此处介绍的方法是基于 Yan 等描述的 Amersham Biosciences Plus One 银染试剂盒 (2000b)。他们发现这个方法适合 MALDI 和 ESI-MS 质谱,与其他银染方法(包括方案 11 中叙述的方法)相比,此法可处理少量制备样品且没有负染色效果。但是,这个过程与标准银染法相比灵敏度不够高。与 MS 兼容的银染方法,见 Shevchenko 等(1996)、Scheler 等(1998)、Gharahdagh 等(1999) 和 Sinha 等(2001)。

        材料与仪器

        步骤

        方案12 与质谱兼容的银染法实验
        1.将凝胶放在含 250 ml 固定液的平皿中,在摇床上摇动 5 min。如果有多块凝胶要固定,应在单独的平皿中染色。

        2.从平皿中排尽固定液,用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶。不允许戴手套的手直接和凝胶接触。再加 250 ml 固定液,继续摇 15 min。

        3.弃去固定液,在平皿中再次加人 250 ml 敏化液,在往复式或定轨式摇床上摇动 30 min。

        4.从培养皿中排尽固定液,在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶,加足够董的去离子水来覆盖凝胶。在摇床上摇动凝胶 5 mm。

        5.排尽水,重复水洗 2 次以上。

        6.在步骤⑦之前 30?60 min 制备银染溶液。

        对 4 个标准大小的凝胶,IL 银染溶液是足够的。

        7.排尽平皿里的水,支持凝胶在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸醋薄片。在每个平皿中加 250 ml 银氨溶液在往复式或定轨式摇床上摇 20 min,摇动时间可缩短至 15 min。如有必要,应至少 15 min,不超过 20 min。

        8.将银氨染色溶液倒人一个合适的废物缸中,确保不用戴手套的手接触凝胶。

        9.加足够的水来覆盖凝胶。在摇床上摇 5 min。

        10.排尽水,将第一次洗液倒入盛有硝酸银的废物缸。重复用 H2O 洗 2 次以上。

        11.当洗凝胶时,制备显色液和终止液。将终止液放在易操作的位置以避免显色和终止之间的延迟。

        12.从平皿中排尽水,在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶。在培养皿中加 250 ml 反应液。在放有白纸的摇床上摇动。

        白纸可提高被染色蛋白和背景之间的反差,提高决定反应终止点的准确度。

        实验提示:一次不要同时显色 3 块以上的凝胶。准备显色凝胶之前在 H2O 中保存其他凝胶。合适的显色时间随每块胶的不同而不同。单独观察凝胶决定显色终止的合适时间。当蛋白质点出现黑色或小的蛋白质点变明显时,这一时间是较合适的。第一个蛋白质点出现约需 lmin。注意不要过度显色。合适的时间通常约为 5~lOmin。

        13.当凝胶充分显色后,将显『色液倒人合适的废物缸内。在平皿中用方形塑料纸或聚碳酸酯薄片支持凝胶,快速将 250 ml 终止溶液倒人平皿中,在摇床上摇动 IOmin0

        14.弃去终止液,用 H2O 覆盖凝胶,在摇床上摇动 5 min。

        15.倒掉水,重复水洗 2 次以上,准备对凝胶进行扫描分析或质谱分析。

        实验提示:Gharahdaghi 等(1999) 曾报道,在凝胶消化前,脱色以除去银颗粒可能会提高质谱的效果。

        来源:丁香实验

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