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        制备藻胆色素蛋白标志物

        相关实验:转运反应成分的制备实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1. 在一微量离心管中,4℃,10000 g 离心 APC 悬浮液 5~10 分钟,吸走上清。

        2. 用 0.1 mol/L HEPES(pH 7.4),0.1 mol/L NaCl 重悬浮沉淀至浓度为 5 mg/ml。用这种缓冲液透析几次去除残留的硫酸铵。

        3. 临用前用透析液溶解硫代 SMCC,浓度为 10 mg/ml。

        4. 按 0.1 mg 硫代-SMCC/1 mg APC 的比例将硫代-SMCC 加到蛋白质中,冰上孵育 45 分钟。

        5. 将修饰后的 APC 过一 5 ml 的 Sephadex G50 脱盐柱,柱子预先用 0.1 mol/L HEPES,(pH 7.4),0.1 mol/L NaCl 和 1 mmol/L EDTA 平衡。

        6. 通过真空透析或用一离心浓缩装置将 APC 浓缩为 5 mg/ml。

        7. 用含 0.4 mmol/L 的三(2-羧乙基)盐酸磷的 G50 柱缓冲液溶解要偶联的肽。

        8. 按 1~5 倍的摩尔比例将肽加到含有被修饰的 APC 的试管中,TCEP 的终浓度应为 0.1 mol/L 4℃ 温和搅拌过夜。

        9. 加入半胱氨酸至 5 mmol/L 以封闭交联剂中没反应的 APC-马来酰亚胺基团,4℃ 孵育 1 小时。

        10. 用 Sephadex G50 脱盐柱或离心浓缩器将 APC-肽聚合物与自由肽分离开来。

        11. 将 APC-肽浓缩为 1~2 mg/ml,分成小份在液氮中冷冻,-80℃ 保存。

        来源:丁香实验

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