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        酪氨酸激酶

        相关实验:用蛋白质底物进行蛋白质激酶分析实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1. 制备酸变性的烯醇化酶

        从兔肌肉中纯化的烯醇化酶通常以硫酸铵沉淀或者悬液的形式存在。

        (1) 含 100 μg 的烯醇化酶,于 4℃ 全速离心 5 分钟。

        (2) 去上清,加入含有 1 mmol/L DTT 的 10 μl 50 mmol/L HEPES 缓冲液(pH 7.0),彻底混匀,冰浴 30~60 分钟。

        (3) 加 10 μl 甘油,混匀,如果当天进行分析实验就放在冰上。

        (4) 马上分析前,往烯醇化酶溶液加 20 μl 100 mmol/L 乙酸,彻底混匀。于 30℃ 水浴 5 分钟,然后放在冰上。

        2. 在冰浴的离心管内配制如下 20 μl 反应混合物:

        5X 酪氨酸激酶分析缓冲液                             4 μl 

        酸变性的烯醇化酶                                        1 μl

        [γ-32P] ATP(终浓度 5 μCi/5 μmol/L ATP)    1 μl

        水(取决于下一步所加的激酶样品的量)        0~14 μl

        5X 酪氨酸激酶分析缓冲液:

        100 mmol/L HEPES (pH 7.4)

        5 mmol/L MnCl2

        5 mmol/L DTT

        500 μmol/L Na3VO4

        3. 加入 1~14 μl 激酶样品开始反应。

        4. 于 30℃ 继续反应一定时间,然后加入 20 μl 冰冷的 2X SDS-PAGE 加样缓冲液终止反应。混匀后,沸水浴煮 3 分钟。然后可以用于 SDS-PAGE 分析、TCA 沉淀计数和/或放射自显影检测。

        来源:丁香实验

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