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        胰岛素受体与[125I]胰岛素的交联实验

        相关实验:胰岛素受体与[125I]胰岛素的交联实验

        最新修订时间:

        原理


        材料与仪器

        步骤

        材料与设备

        纯化的鼠肝细胞质膜(见本单元实验 1)

        部分纯化的胰岛素受体,得自 WGA-琼脂糖柱层析(见本单元实验 3)

        纯化的胰岛素受体,得自胰岛素琼脂糖柱层析(见本单元实验 4)

        [125I] 胰岛素(受体级)(DuPont NEN NEX 196)

        猪胰岛素(17.5umol/L)(如,Sigma Chemical Co.13505)

        双琥珀酰亚胺酰辛二酸(Pierce Chemical Co.21555)

        二甲亚砜(DMSO)

        NH4Cl(1mol/L)

        甘油(10%;v/v)

        蛋白质凝胶电泳装置(BioRad Laboratories 或 Hoefer Scientific Instruments)

        干胶器 (Bio-Rad Laboratories 或 Hoefer Scientific Instruments)

        试剂

        SDS-PAGE 样品缓冲液(5x)

        (配方,见 试剂的配制,pp.234~240)

        操作程序

        1)建立如下反应体系:

        胰岛素受体与[125I]胰岛素的交联实验

        2) 反应混合物于室温孵育 2 h。

        3) 溶双琥珀酰亚胺酰辛二酸于 DMSO 中,使终浓度为 10 mmol/L。

        4) 每管加入 6ul 10 mmol/L 双琥珀酰亚胺酰辛二酸,室温孵育 1 min。

        5) 加1ul 1mol/L NH4Cl 终止反应。

        6) 加 15ul 5xSDS-PAGE 样品缓冲液。

        7) 样品煮沸 5 min。

        8) 加样至 7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。170V 电压下电泳,至染料前沿跑出凝胶。(关于 SDS-PAGE 的详细资料,见附录 5)

        9) 将凝胶置 10% 甘油中孵育后,在干胶器上干燥。
        注:蛋白质也可转移至硝酸纤维素膜上,如本单元实验 6 所述。

        10)用放射自显影法鉴定亲和标记的胰岛素受体。

        结果

        交联实验的典型结果如图 4-6 所示。

        胰岛素受体与[125I]胰岛素的交联实验

        来源:丁香实验

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