实时 PCR 实验

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

以 50ul 反应体系为例。

Platinum Quantitative PCR Super Mix-UDG(Invitrogen11730-025)         25ul

ROX 染料（Invitrogen12223012)                                                       1ul

灭菌的蒸馏水（Gibco15230-162)                                                      12ul

10umol/L 反向引物                                                                              1ul
 
10umol/L 正向引物                                                                              1ul

小计                                                                                                     40ul

溶于 0.1XTE 或无菌水的模板                                                              10ul

总计                                                                                                     50ul

2. 专门的仪器

ABIPRISM7700 型号系列检测系统。

二、方法

1.PCR 温度循环程序

a. 三步循环法

50°C，保持 2 min(消化 UDG)。

95°C, 保持 2 min(使模板变性；使尿嘧啶 DNA 糖基化酶失活；使热启动：Taq 聚合酶活化）。

95°C，15s；55°C，30s；72°C，30s, 进行 45 个循环。

b. 二步循环法

50°C，保持 2 min(消化 UDG)。

95°C，保持 2 min(使模板变性；使尿嘧啶 DNA 糖基化酶失活；使热启动 Taq 聚合酶活化）

95°C，15s；60°C，30s，进行 45 个循环。

2. 解链曲线分析程序

a.PCR 反应的程序：40°C，1min；95°C，19 min；25°C，孵育 2 min。许多实时 PCR 仪器都配有相应的软件，该软件提供有荧光强度与解链温度之间的导数关系曲线。

b. 考虑到反应体系中的离子环境，目的产物的 PCR 只有一个峰值，这才是理想的结果。如果扩增了不止一个产物和/或产生了引物二聚体，就会产生多个峰，当然引物二聚体的解链温度通常比 PCR 目的产物低。所以，解链曲线分析可以迅速有效地、很好地控制定量 PCR 的进程。

c. 用 c-myc 特异 LUX 引物（表 15-1) 进行实时 PCR 的结果见图 15-2[(a) 图见封二彩图]。进行实时定量 PCR 时，先把 c-myc 质粒从 10~10⁷ 拷贝的范围内进行系列稀释试剂按上面描述的体系进行混合，使用 SuperMix-UDG(2 卞反应混合物）。结果表明应用LUX 实验平台进行实时定量 PCR 可以进行 100 或更少拷贝的目的基因的扩增，并可以得到 7 个数量级的动态曲线。