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        制备抗体Sepharose 偶联物

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1.  1 ~30 mg/ml 的抗体在 4℃对 0.1 mol/l NaHCO3 / 0.5 mol/l NaCl透析 24 h,期间换液3次。透析液的体积应500倍于抗体溶液。

        2.  于4℃10 000 g 离心1 h,除去聚集体。
         
        3.  取小份上清测A280确定抗体的浓度。用0.1 mol/l NaHCO3 / 0.5 mol/l NaCl稀释抗体至5 mg/ml,于4℃保存。测此溶液的A280

        4.  让浆状的Sepharose在烧杯中沉降,吸出并弃上清。称出与抗体溶液体积相等的Sepharose。
         
        5.  用Whatman 1号滤纸、布氏漏斗、Erlenmeyer三角抽滤瓶并将之连接到水泵上组装 一套过滤装置,以10倍体积的水洗Sepharose

        6.  将Sepharose移至50 ml 烧杯,加入等体积的0.2 mol/l Na2CO3

        7.  在室温按每100 ml Sepharose加3.2 ml CNBr/乙腈的量活化Sepharose。在磁力搅拌器轻柔搅拌下,慢慢用巴斯德吸管滴加CNBr,时间在1 min 以上,然后继续轻柔搅拌5 min。
         
        8.  按步骤5快速过滤Sepharose,抽气至半干状(即抽至成块状的Sepharose干裂,并失去光泽)。

        9.  用10倍体积的冰冷1 mmol/l HCl洗涤,接着以2倍体积的0.1 mmol/l HCl洗。

        10.  以足够的冰冷0.1 mmol/l HCl让Sepharose复水,使之重新恢复光泽,但液体不要超出其表面。
         
        11.  立即将称量好的Sepharose移至一烧杯,加入溶解于0.1 mol/l NaHCO3 / 0.5 mol/l NaCl中的等体积抗体溶液。用磁力搅拌器室温搅拌2 h 或4℃过夜。
         
        12.  加入50 mmol/l 的pH8.0的甘氨酸(或乙醇胺)溶液,以饱和Sepharose上的剩余活性基团,并让胶浆沉降。吸出部分上清,离心去残余Sepharose后,测其A280,并与步骤2测出的抗体溶液的浓度比校,以确定偶联效率。

        13.  抗体-Sepharose保存于TSA溶液。

        来源:丁香实验

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