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        考马斯亮蓝染色

        相关实验:蛋白质染色实验

        最新修订时间:

        原理

        1. 凝胶中蛋白质的定位可用考马斯亮蓝染料染色或银染色。前者简便且快捷,而银染法具有相当高的灵敏度,能用于检出更少量的蛋白质。


        2. 蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化,从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。


        3. 考马斯亮蓝在酸性条件下为棕红色,其所含的疏水基团在酸性条件下雨蛋白质的疏水区具有亲和力,通过疏水作用与蛋白质相结合,形成蓝色的蛋白质染料复合物,在595nm处有最大吸光度,在一定的蛋白质浓度范围内,蛋白质染料复合物在595nm下的吸光度与蛋白质量成正比。

        材料与仪器

        步骤

        1.  将聚丙烯酰胺凝胶放在塑料容器并以3~5倍体积的固定液覆盖,在旋转摇床中缓慢揺动2 h。
         
        2.  倾去固定液,以考马斯亮蓝染色液覆盖凝胶,并缓慢摇动4 h。

        3.  倾去染色液,用约50 ml 固定液冲洗凝胶。
         
        4.  倾去固定液,以脱色液覆盖凝胶,缓慢摇动2 h,倾去脱色液,再加入新脱色液同时至获得蓝色条带及干净的背景。凝胶可放置在乙酸或水中保存。

        5.  需要时,给凝胶拍照。
         
        6.  另外,也可将凝胶放在两张Whatman 3MM 滤纸上,顶上盖上塑料保鲜膜。在常规的凝胶干燥机中于80℃干燥1~2 h。

        注意事项

        1.  带手套并仅在通风橱中进行。


        2.  由于氨银溶液干燥后会发生爆炸,应马上用大量水冲去。


        3. 不可使用石英比色皿(染色不易洗掉) ,可用塑料或者玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇荡洗,以洗去染色。塑料比色皿决不可以用乙醇或丙酮长时间浸泡。


        来源:丁香实验

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