• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        竞争法测抗原

        相关实验:酶联免疫吸附(ELISA)实验

        最新修订时间:

        原理

        竞争法测抗原

        图1:竞争法测抗原示意图


        本法首先将特异性抗体吸附于固相载体表面,我们把抗原和抗体吸附到固相载体表面的这个过程,称为包被(Coated),也可叫做致敏。经洗涤后分成两组:一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液,而另一组只加酶标记抗原,再经孵育洗涤后加底物显色,这两组底物降解量之差,即为我们所要测定的未知抗原的量。
         
        这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可,因此,对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。该法的优点是快,因为只有一个保温洗涤过程。但需用较多量的酶标记抗原为其缺点。

        材料与仪器

        步骤

        一、包被抗体:用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度(1~10 ug /ml),每凹孔加0.3 ml,4℃过夜,或37℃水浴3小时,贮存冰箱。
         
        二、洗涤:移去包被液,凹孔用洗涤缓冲液(含0.05%吐温-20)洗3次,每次5分钟。
         
        三、分2组,a组加酶标记抗原和被检抗原混合液0.2 ml,b组只加酶标记抗原液0.2 ml,37℃作用1~2小时。(混合液可作成不同稀释度)
         
        四、洗涤:移去包被液,凹孔用洗涤缓冲液(含0.05%吐温-20)洗3次,每次5分钟。
         
        五、加入0.2 ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT),室温作用30分钟(另作一空白对照,0.4 ml底物加0.1 ml终止剂)。
         
        六、加终止剂:每凹孔加2 M H2SO4或2 M柠檬酸0.05 ml。
         
        七、用酶标比色计测定a、b两组OD值,并求出a、b、OD值的差数。

        常见问题

        一、影响ELISA的因素

        1.  试验的重复性(精确度)

        有二种方法来检验试验的精确度:通常用变异系数来表示:1、几个样品用ELISA法同时进行多次测定求出CV%;2、不同时间对不同操作者对某几个样进行多次测定求出变异系数。CV是个体参数标准差与平均数的比率。
         
        S / X = CV ,CV应低10%,不应大于10~15%。
         
        不论目测或分光光度计测定,均可作一个稀释度或一系列稀释度测定,一般常规诊断只用一个稀释度判断阳性或阴性就可以了,这样比较方便,现在推荐传染病的血清诊断用1:200一个稀释度。有些需要精确定量的,可作一系列稀释度测定。
         
        记录结果有下列几种方法:
         
        1、“+”或“-”:所有超过规定的OD值(如OD,0.4)的标本均属阳性,此规定OD值是根据事先测定大量阴性标本所取得的,此规定值是阴性标本的上限。或者以一组阴性标本OD平均值加2~3个标准差作为阳性阈值。
         
        2、直接以OD值来表示,如0.4、0.7、1.2,OD值越大,阳性反应越强,但此数值是在固定实验条件下得到的结果,而且每次实验都要有参考标本作对照。
         
        3、以终点滴度表示:将标本作连续稀释,最高稀释度能出现阳性反应者(即OD值仍大于阳性阈值,即为该标本的滴度。
         
        4、以“比值表示:求出被检标本的OD值与一组阴性标本OD值的比值,例如为阴性标本的2倍或3倍,即为阳性,比值小于2.1而大于1.5为可疑,<1.5为阴性。
         
        测定标本OD值-空白OD值
         
        竞争法测抗原
         
        阴性对照OD值-空白OD值
         
        如在此测定时以空白校正“O”点。
         
        5、以“单位”来表示:在测定被检标本的同时,再测定一个含已知单位数的阳性参考血清,用不同稀释度作ELISA检测后,以OD值为纵坐标,单位数为横坐标,画出标准曲线。以后可根据被检标本的OD值,从曲线上找出相应的单位数,再乘于血清的稀释倍数,即可得出被检标本的单位数。
         
        作试验时的阴性参考血清最好不要显色,否则会对结果判断带来困难,特别在目测时,当阳性标本OD值>2.0时,应作适当稀释后再作测定。
         
        2.  对使用仪器要求

        所用仪器如吸管、烧杯试管都要清洁,用于酶结合和底物的吸管和容器一定要分开。试剂要求标准化。
         

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序