酶消化法

一、小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤

1.  于无菌条件下切取鼠头并以75%酒精浸泡1 min，解剖出完整鼠脑。

2.  预冷解剖液中分离去除软膜、血管、取大脑皮质漂洗，用眼科剪将皮质反复剪切成碎块。

3.  移入培养皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2 ml，37℃培养箱中消化30 min。

4.  将皮层组织碎块移入离心管，弃去剩余消化液，用接种液洗3次，每次洗涤后使组织块充分沉降到试管底，弃去上清液。

5.  最后再用接种液1 ml混悬，反复吹打（巴氏吸管）混悬液中组织块，力度适中，至浑浊后将上清液移入培养瓶待用。

6.  加入1ml接种液后再次吹打，如此反复3-4次，组织块逐渐消化后，弃去最终残块。

7.  收集含单细胞悬液的上清液约4-5 ml于培养瓶中，以接种液重新悬浮细胞，细胞记数；接种1x10⁷个细胞于6孔培养板中。

8.  培养24 h至细胞贴壁后，换全培养液（DMEM/F12+2%B27）培养3d，观察神经元生长状况。

9.  换用阿糖胞苷培养液、  每隔3d换全培养液1次，每次换半液。

二、神经元免疫化学鉴定

1.  4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS洗涤3次。

2.  加入无水甲醇:30%双氧水（5:1）处理30 min，PBS洗涤3次。

3.  加入5%羊血清封闭20 min，弃去多余液体。

4.  加入Rabbit Anti-NSE（1:100）（神经元特异性烯醇化酶），培养箱中孵育2-4 h，PBS洗涤3次。

6.  加入DAPI染液（1:40），室温放置5-10 min；PBS洗涤3次。

7.  荧光显微镜观察。 

三、结果      

图1： 刚接种时细胞图

图2： 刚接种时细胞图培养1d后

图3： 刚接种时细胞图培养2d后

图4： 刚接种时细胞图培养3d后

图5： 刚接种时细胞图培养4d后

图6： 刚接种时细胞图培养5d后

图7： 刚接种时细胞图培养6d后

图8：第7d免疫鉴定图