• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        Heochst 33342/PI双染色法

        相关实验:流式细胞仪检测细胞凋亡实验

        最新修订时间:

        原理

        流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”,因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。活细胞染料如Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高,Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜通透性发生改变有关,凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变,但细胞膜的通透性已有增强,因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多。


        此外,还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。既然Hoechst 33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易,而EB、PI或7-AAD等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中,即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染,坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损,可被这些染料染色。


        根据这些特性,用Hoechst 33342结合PI或EB等染料对凋亡细胞进行双染色,就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上,这三群细胞表现分别为:正常细胞为低蓝色/低红色(Hoechst 33342+/PI+),凋亡细胞为高蓝色/低红色(Hoechst 33342++/PI+),坏死细胞为低蓝色/高红色(Hoechst 33342+/PI++)。


        材料与仪器

        步骤

        一、细胞培

        悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst 33342 ,终浓度为1 ug/ml; 37℃孵育7-10 min。
         
        二、细胞收集

        低温500 ~ 1 000 r/min离心5min弃去染液。
         
        三、染色

        加入1.0 ml PI染液,4℃避光染色15 min。
         
        四、过滤

        400目的筛网过滤1次。
         
        五、流式细胞仪分析

        Heochst 33342用氪激光激发的紫外线荧光,激发光波波长为352 nm,发射光波波长为400 ~ 500 nm,产生兰色荧光;PI用氩离子激光激发荧光,激发光波波长为488 nm,发射光波波长大于630 nm,产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。
         
        六、结果判断

        在兰色荧光对红色荧光的散点图上,结果为:正常细胞为低蓝光/低红光,凋亡细胞为高蓝光/低红光,坏死细胞为低蓝光/高红光。

        注意事项

        1.  在红色荧光对兰色荧光散点图上,还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹,可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。
         
        2.  用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长,一般控制在20 min之内为宜。如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移,导致红色荧光与兰色荧光的比例改变,从而影响结果的判断。

        常见问题

        1.  在红色荧光对兰色荧光散点图上,还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹,可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。

         

        2.  用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长,一般控制在20 min之内为宜。如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移,导致红色荧光与兰色荧光的比例改变,从而影响结果的判断。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序