Th细胞表位的鉴定

实验分类：

免疫学实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

Th 细胞表位的鉴定方法主要包括两种，一种是先从患病机体（如肿瘤、病毒感染等）或抗原免疫后机体获得肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）淋巴结细胞或 PBMC。体外用抗原刺激后，进行有限稀释，或分离出 CD4⁺T 细胞，进行有限稀释。然后再用 γ 射线照射后或丝裂霉素 C 处理后的与相应抗原或其片段孵育过的 PBMC、EB 病毒（EBV）转化后 B 细胞、DC 等作为 APC，用于刺激细胞，获得 CD4T 细胞克隆。最后，采用相同的刺激方法，用交叠肽从细胞上分离得到的多肽等刺激 CD4T 细胞克隆，通过细胞增殖、细胞因子分泌等的检测确定 Th 细胞表位。

原理

Th 细胞表位鉴定的另一种方法的基本原理是直接通过表位预测或合成交叠肽等获得候选多肽，经多肽结合实验初步筛选后，直接或与 PBMC、EBV 转化后 B 细胞、DC 等一起孵育后刺激 CD4^＋T 细胞，通过细胞增殖检测、MHC 限制性分析及细胞因子分泌检测等确定 Th 细胞表位。

来源：丁香实验团队

操作方法

抗原特异性CD4＋T细胞克隆的建立

抗原特异性 CD4＋T 细胞克隆的建立的基本过程可分为如下几步：1．分离获得 TIL、淋巴结细胞、PBMC 采用常规组织淋巴结分离方法如分离淋巴结后，100 目筛网研磨分离获得 TIL 或淋巴结，淋巴细胞分离液密度梯度离心法获得 PBMC。2．加入 2～10 μg/ml 抗原，37 ℃、5% CO2 培养。1 周后，重复刺激 1 次。3．用与抗原孵育过的、照射后或丝裂霉素 C 处理后 APC 刺激

酸洗脱法获取抗原多肽（Th细胞表位的鉴定）

酸洗脱法获取抗原多肽是指用一定强度的酸性缓冲液可将表位多肽和 β2M 从细胞表面洗脱下来，通过分离、纯化即可获得 Th 细胞表位多肽。

表位预测法获取抗原多肽（Th细胞表位的鉴定）

表位预测法获取抗原多肽方法是指特定 Th 细胞表位多肽的氨基酸组成有其特定的规律，因此可以采用计算机预测的方法获取抗原多肽。

交叠肽合成法获取抗原多肽片段

交叠肽合成法获取抗原多肽片段方法，是指通过人工合成的方法获得一系列氨基酸交叠的多肽。

亲和层析纯化MHC II类分子测定多肽亲和力

亲和层析纯化 MHC II 类分子测定多肽亲和力方法的基本流程如下：（1）将抗 MHC II 类分子单克隆抗体连接到琼脂糖凝胶 CL-4B（Sepharose CL-4B）上，装柱，制成抗体-Sepharose CL-4B 亲和层析柱。（2）裂解后的细胞溶液过未活化的 SepharoseCL4-B 柱和蛋白 A-Sepharose 柱 2 次后，过抗体-Sepharose CL-4B 亲和层析柱。

采用多肽结合竞争抑制实验测定目标多肽与MHCI类分子结合的相对亲和力

肽结合抑制实验测定多肽亲和力方法的基本流程如下：（1）合成、制备荧光素或 125I 等标记的、能与相应 MHC II 类分子高亲和力结合的已知 Th 细胞表位多肽。（2）在有蛋白酶抑制剂存在的条件下，将目标多肽和 5～500 nmol/L MHC II 类分子、1～10 nmol/L 标记后 Th 细胞表位多肽一起室温孵育 48 小时。过凝胶柱，分离获得 MHC II 类分子-多肽复合物。（3）测

肽特异性CD4＋T细胞的诱导

肽特异性 CD4＋T 细胞的诱导方法是指在体外用多肽进行刺激，制备效应细胞，以便后续进行 CTL 活性的检测。这是效应性细胞毒性 T 细胞的体外诱导方法的一种方法，除多肽刺激制备效应性细胞毒性 T 细胞方法外，还可用多肽孵育后 TAP 缺陷细胞刺激、多肽孵育后 DC 刺激法制备效应性细胞毒性 T 细胞。

细胞增殖实验

1．将用前述方法建立的抗原特异性 CD4＋T 细胞克隆、刺激后 PBMC 或刺激后 CD4＋T 细胞铺于 96 孔细胞培养板，每组设 3 复孔。按 1:2～10:1 的比例加入用前述方法制备的 APC。2．共培养 2～5 天后，每孔加入 0.5～1 μ Ci H-胸腺嘧啶核苷（H-thymidine，3'H-TdR），37 ℃、5% CO2 孵育 16 小时。3．收集细胞于玻璃纤维纸上，测定 cp

MHC限制性确定

Th 细胞表位的 MHC 限制性一般通过测定 MHC II 类分子特异性单克隆抗体对抗原诱导的 T 细胞增殖的抑制来确定，其基本方法与细胞增殖实验相同，并与细胞增殖实验同步进行。

酶联免疫吸附实验（ELISA）测定IFN-γ细胞因子

酶联免疫吸附实验（ELISA）测定 IFN-γ 细胞因子方法是利用 ELISA 实验测定细胞因子 IFN-γ。

反转录PCR测定IFN-γ细胞因子方法

反转录 PCR 测定 IFN-γ 细胞因子方法是利用 RT PCR 技术检测 IFN-γ 细胞因子的一种方法。

ELISPOT检测细胞因子IFN-Y

ELISPOT 检测细胞因子 IFN-γ 方法是采用酶联免疫斑点法（ELISPOT）技术检测 Th 细胞在抗原刺激下分泌 IFN-γ 的情况。