方案4 浓缩聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质点实验

1.切下二维凝胶目的蛋白点，每个点分别放置于 10 ml 的聚丙烯管，用 9 ml 水重新水化。

注意不要将这些蛋白点搞混。从不同的凝胶上获得的相同的蛋白点可以在一个聚丙烯管中处理。

2.用 9 ml 水洗涤重新水化的胶块，共洗 5 次，每一次约 5 min。

3.弃去最后一次洗涤的水，加人平衡缓冲液以浸没胶块，室温下平衡胶块 lh。

4.向巴氏滴管末端滴人 5% 的琼脂糖溶液，放置片刻使其凝固。然后向巴氏滴管中滴加浓缩胶。

5.通过管式凝胶接合器将滴管嵌人 Protean Ⅱ xi2-D 电泳槽，每一块凝胶上加 0.5 ml 的水。

6.使凝胶聚合 [凝胶的详细情况，见图 6.19(a)]。弃去滴管顶端的水，加人平衡的凝胶点和平衡缓冲液（从步骤3制得）[见图 6.19(b)]，凝胶块和平衡缓冲液总体积不得超过 0.5 ml。剩下的滴管体积用聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液充满。

7.室温下在 Protean Ⅱ xi2-D 电泳槽中以 250V 电压电泳，直至染料到达滴管末端。

8.停止电泳。以一个 2 ml 的注射器在滴管末端施加温和的压力，将浓缩了的凝胶自滴管取出。

9.将浓缩了的凝胶放入装有 30 ml 考马斯亮蓝染色液的 50mi 试管中，室温下染色 10?20 min。

10.以脱色液脱色。

11.将切下染色的蛋白质条带做进一步鉴定。例如，进行内部序列分析（见第 7 章），或电印迹到 PVDF 膜以后直接进行 Edman 降解（见方案 2)。