融合蛋白的酶解实验

1. 准备两个小量预试验反应以确定最佳温育时间： （1）反应1：20 μl 含有1 μl 200 μg/ml Xa因子的1 mg/ml 融合蛋白，室温下反应 （2）反应2：5 μl 不含因子Xa的1 mg/ml 融合蛋白（模拟消化），室温下反应。 2. 分别在2、4、8和24 h取出5 μl 反应液，加2×SDS样品缓冲液5 μl，-20℃下冻存。 3. 在24

1. 将融合蛋白在≥10倍体积的20 mmol/l Tris·Cl（pH7.4）/6 mol/l 盐酸胍中透析4 h，或将盐酸胍加入融合蛋白中至终浓度为6 mol/l。 2. 将样品在100倍体积的20 mmol/l Tris·Cl（pH8.0）/1 mmol/l CaCl2透析4 h。 3. 更换100倍体积的新鲜缓冲液重复步骤2，继续透折4 h。 4. 按“基本方

1. 准备两个小量预试验以确定最佳裂解反应条件： （1）反应1：20 μl 1 mg/ml 融合蛋白溶液（在合适的缓冲液中）及0.2 μg 凝血酶。 （2）反应2：5 μl 1 mg/ml融合蛋白溶液（模拟消化），25℃下温育反应。 2. 在30 min、1 h、2 h 和4 h 等时刻从反应1中分别取出5 μl 反应液与5 μl 2×SDS样品缓冲液混匀，-20℃冷

1. 将融合蛋白在≥10倍体积的20 mmol/l Tris·Cl（pH7.4）/6 mol/l 盐酸胍中透析4 h，或将盐酸胍加入融合蛋白中至终浓度为6 mol/l。 2. 将样品在100倍体积的20 mmol/l Tris·Cl（pH8.0）/1 mmol/l CaCl2透析4 h。 3. 更换100倍体积的新鲜缓冲液重复步骤2，继续透折4 h。 4. 按“基本方

1. 在20或50 ml 带球旋盖的试管中，用20倍体积含1%Triton X-100的PBS液洗涤结合在谷胱甘肽-琼脂糖珠的GST融合蛋白。室温下，在台式离心机上以500 g 离心10 s 沉淀琼脂糖珠，小心弃上清，将谷胱甘肽-琼脂糖珠重悬于20倍体积的Triton X-100缓冲液中，重复洗涤1次。 2. 第二次离心后，小心弃上清，用20倍体积的GST洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽-琼脂糖珠

1. 做预试验监测肠激酶与融合蛋白按不同比例混合后的裂解效率，准备5个反应体系： （1）反应1至4：20 μl 融合蛋白；0.2 U、0.5 U、1 U和2 U的rEK，加50 mmol/l Tris·Cl（pH8.0）/1 mmol/l CaCl2至总体积30 μl。 （2）反应 5：20 μl 1 mg/ml 融合蛋白，10 μl 50 mmol/l Tris·Cl（pH8