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        备选方案2

        相关实验:融合蛋白的酶解实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1.  在20或50 ml 带球旋盖的试管中,用20倍体积含1%Triton X-100的PBS液洗涤结合在谷胱甘肽-琼脂糖珠的GST融合蛋白。室温下,在台式离心机上以500 g 离心10 s 沉淀琼脂糖珠,小心弃上清,将谷胱甘肽-琼脂糖珠重悬于20倍体积的Triton X-100缓冲液中,重复洗涤1次。

        2.  第二次离心后,小心弃上清,用20倍体积的GST洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽-琼脂糖珠。

        3.  离心沉淀并弃去上清,将谷胱甘肽-琼脂糖珠重悬于20倍体积的凝血酶裂解缓冲液中,重复离心并再重悬于≤1 ml 的凝血酶裂解缓冲液中。 

        4.  取出一小份重悬的琼脂糖珠,在其中加入等体积的2×SDS样品缓冲液,-20℃贮存以备SDS-PAGE分析用。

        5.  将凝血酶以1%的比例加入剩余的谷胱甘肽-琼脂糖珠混悬液,25℃下保温反应1 h。

        6.  用1柱床体枳的GST洗涤缓冲液洗脱已裂解释放的蛋白,如步骤1所述离心沉淀谷胱甘肽-琼脂糖珠,收集上清,重复5次,但分开保存毎次洗涤后的馏分,各取20 μl 用于SDS-PAGE。
         
        7.  用GST冼脱缓冲液替换洗涤缓冲液,重复步骤6。洗脱与介质结合的GST。从毎个级分中取出20 μl 用于SDS-PAGE分析,以确定裂解程度,此胶上应包括步骤4留存的样品。

        来源:丁香实验

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