RNA 实验

单链DNA文库的SELEX筛选实验可用于：（1）体外诊断；（2）体内治疗等。

RNA 实验技术手册（分子克隆-实验指南系列）

RNA 实验技术手册（分子克隆-实验指南系列）

RNA 实验技术手册（分子克隆-实验指南系列）

RNA 实验技术手册（分子克隆-实验指南系列）

从聚内烯酰胺凝胶中回收 RNA 片段最好的方法是粉碎浸泡法。此法能从变性胶屮很好的回收高纯度的单链 RNA。但是此法不适用于长转录产物，因为它既费时间效率又低，例如: 超过 3kb 的 RNA 的回收效率不到30%。但是对于回收小片段 RNA 此方法是十分有效的。

利用 DNA 聚合酶 I 的大片段（Klenow 酶）的 3＇— 5＇外切酶活性将 3＇黏性末端转化成平末端。具体方法是在体外转录体系尚未加入核苷酸和 RNA 聚合酶时，加入 Klenoow 片段 (终浓度为 5U/ug)，于 22℃ 孵育 15mim, 然后再加入核苷酸混合物和RNA 聚合酶

RNA 标准转录体系的一般回收率为 lugRNA/ug 质粒 DNA, 使用下面的方法，可以提高回收率至 5〜l0ug RNA/ug 质粒 DNA。大量制备 RNA 可以用于体外翻译。

光化学交联技术是研究核搪核蛋内复合物中 RNA 与蛋白的相互作用的有效手段。 其基本原理是未经任何化学修饰的 RNA -蛋白天然复合物在短波长紫外线（254 nm ) 照射时，RNA 中的核苷酸和蛋白质中的氨基酸会产生光化学反应，转变为活性状态，进而形成分子间共价交联。本实验来源「RNA 实验指导手册」主编：郑晓飞。

PAT法 [ PCR poly(A) test ] 可以快速、灵敏地从总 RNA 中分析特异 mRNA，而且可以定量估算 RNA poly(A) 尾长度。这方法中，包括 cDNA 合成的整个操作过程都在一个反应管中完成，不仅操作更简便，也减少了可能存在的 RNase 污染。本实验来源「RNA 实验指导手册」主编：郑晓飞。

Fe（II）-EDTA 能够催化 RNA 或 DNA 的断裂，是 RNase 保护分析的一个补充方法，其优点是很少或没有碱基序列的特异性，其沿着整个长度的 RNA 或 DNA 链的剪切几乎是一致的，它可被用于解释一些 RNA 的较高级的折叠方式。本实验来源「RNA 实验指导手册」主编：郑晓飞。

基因分子鉴定的一个重要方面就是其 RNA 转录物 5' 和 3' 端的精确作图。首先被 Maniatis 研究组使用的 RNase 保护测定法就是基于这个目的发展起来的。由于杂交是在溶液中实现的，因此也称为溶液杂交。本实验来源「RNA 实验指导手册」主编：郑晓飞。

原位杂交（msituhybridization，ISH)，也称作杂交组织化学或细胞学的杂交，是一种能够从形态学上证明特异性的 DNA 或 RNA 序列存在于制备的个别细胞、组织部分、单细胞或染色体中的技术。原位杂交是研究异质细胞群中 DNA 和 RNA 序列的细胞定位的唯一方法。本实验来源「RNA 实验指导手册」主编：郑晓飞。

引物延伸法可用于 RNA 的作图和 RNA5＇端的定暈。在此方法中，将过量的 5＇端标记的单链 RNA 引物与待测的 RNA 杂交，随后用反转录酶延伸该引物，生成句 RNA 模板互补的 cDNA。再在变性条件下通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定 cDNA 的长度，即可确定 RNA 端的位置，并且 cDNA 的量将反映出 RNA 的水平。

SI 核酸酶是种内切酶，它是从米曲霉米曲霉 (Aspergillusoryzae) 中分离得到。它能降解单链核酸，却不能降解双链核酸。此外，它能高灵敏度地降解局部错配的双链分子，即使只有一对碱基错配，也能因 S1 核酸酶的切割而被检测出来。用 S1 核酸酶来识别和切割错配或未复性的区域，再通过变性内烯酰胺凝胶电泳分析切割产物。

RNA 的斑点和狭缝杂交分析能够不经凝胶电泳就直接将 RNA 样品点在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后与放射性标记的探针杂交，定性或半定量地测定 RNA。最初是由 Kafatos 等人用于描述 RNA 的斑点杂交。但由于直接将 RNA 样品点在硝酸纤维素膜上会产生圆斑，不便于比较，故人们采用狭槽的装置点样，也称为 SlotBlot。

氢氧化甲基汞和 RNA 中的尿嘧啶和鸟嘌呤上的亚胺键可发生反应，而这些键涉及到 Watson-Crick 碱基配对。因此，氢氧化甲基汞是一种有效的变性剂，能破坏 RNA 的二级结构.在氢氧化甲基汞存在时，RNA 的电泳迁移率是其分子质量的 1g 对数的反函数。由于氢氧化甲基汞可与丙烯酰胺聚合反应中所需的自由基发生反应，因此不能用于聚丙烯酰胺凝胶电泳，而只能用于琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心。

在微酸的条件下，乙二醛的两个乙醛基与鸟苷的亚氨基相互作用形成环状化合物，抑制了链间 Watson-Crick 键的形成，使 RNA不能形成稳定的二级结构,它在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率与其大小的对数成正比。

琼脂糖凝胶电泳常用于 Northern 印迹前分离 RNA

采用分光光度法对核酸进行精确定量，因为这种方法不破坏结构，并且还能回收样品.。RNA 有吸收紫外光的性质，吸收高峰在 260nm 波长处，这是单个核糖核甘酸在 256nm 和 281nm 之间吸收值的平均值。