DNA 实验

通过一种有效的蛋白酶（如蛋白酶 K ) 的消化作用及随后的酚：氯仿抽提，就能从大规模制备的 λ 噬菌体中很好地分离到 DNA。该方法也适用于小量（50~100 ml ) 制备物。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

本实验介绍关于用碱性磷酸酶启动子（phoA) 和信号序列在大肠杆菌中分泌表达外源蛋白的过程。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

本方案适用于制备噬菌体原种、制备噬菌体颗粒（用来获得 DNA 进行亚克隆）以及制备 λ 噬菌体臂。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

λ噬菌体 PL 启动子是受控于温度敏感阻抑物（cIts857) 的强效启动子，阻抑物可在低温下阻抑 PL 启动子的转录，但在髙温下不能。因此带有λ噬菌体启动子的载体必须以带有 cIts857 基因的菌株作为宿主。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

Tabor 和 Richardson 在 1985 年及 Studier 和 Moffatt 在 1986 年提出了一个新的利用 T7 噬菌体启动子的表达系统，使用的是从 T7 噬菌体基因组获得的转录信号。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

本方案将在疑难解析和诱导启动子表达蛋白的优化部分讨论影响质粒表达效率的因素。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

本方法适用于对可免疫检测的融合蛋白进行快速筛选λgtll 重组噬菌体。但在其他条件下（如：对感染率的优化，42°C λ噬菌体基因的失活及裂解前收集)，此方法亦可用于产生制备量的融合蛋白 (Runge1992)。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

从大规模培养物中制备的 λ 噬菌体，可在高盐存在下用聚乙二酵 ( PEG ) 沉淀的办法从裂解物中回收得到。残余的细胞碎片和 PEG 可用氯仿抽提。在进一步纯化之前，建议测定噬菌体制备物的得率。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

λ噬菌体重组体编码的融合蛋白可通过大肠杆菌株 Y1089 溶源化菌落来制备。但从大量单个噬菌斑制备溶源菌工作量大，且并不一定每次成功（Huynh et al.1985)。另外，裂解性噬菌体感染可通过软琼脂（本方案）或液体培养（方案 9) 获得。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

细菌克隆的溶解实验可以用于：（1）从表达特定融合蛋白质的重组噬菌体构建噬菌体溶源菌；（2）从该溶源菌诱导合成并纯化出融合的目的蛋白质。

本节介绍一种利用结合细菌蛋白质的基质去除粗制免疫球蛋白中与细菌编码蛋白质发生反应成分的方法（de Wet et al.1984)。该方法也适用于利用培养的细胞或组织抽提物去除交叉反应抗体。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

本方案介绍一种通过抗血清与细菌裂解液共同温育而从多克隆抗血清中去除与细菌编码蛋白质发生反应抗体的方法。本节介绍的吸收方法仅仅适用于制备含有低滴度抗大肠杆菌抗体的抗血清。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

本节介绍的方法仅仅是制备含有相对低滴度抗大肠杆菌抗体的抗血清。如果处理后的抗血清仍然与宿主成分有高水平的交叉反应，则须在含有固定大肠杆菌成分的层析柱上用亲和层析法进一步纯化。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

检测结合抗体的方法有以下 3 种：放射化学筛选，生色反应筛选及化学发光反应筛选。3 种方法的优缺点在本章导言中有所论述。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

本方案使用核酸酶 BAL31(从海洋细菌 Alteromonas espejiana BAL31 中纯化）在克隆的 DNA 片段中产生单向或双向缺失。BAL31 是一个复合酶，它以非同步的方式消化双链靶 DNA。因此与诸如外切核酸酶Ⅲ这类的加工酶相比，BAL31 产生的缺失更具有不均一性（请见方案 9)。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

逐步地从靶 DNA 的一端或另一端删除多个寡核苷酸的嵌套式缺失突变方法被用来确定功能性顺式调控元件的边界，早先曾作为指导 DNA 测序的模板。该方法依赖于核酸酶，这些核酸酶均以可预测的方式消化 DNA, 其中外切核酸酶 HI 是目前最好的。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

险测突变的目的主要是为弄懂人类遗传性疾病的分子机制，以便有效的针对这些疾病进行预防、诊断和治疗，但更多的是用于分析不同生物体基因型与表型之间的关联。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

这一方法由 Hanahan 和 Meselson (1980, 1983)报道，主要用来处理由质粒 cDNA 文库转化的细菌。将转化菌的混合物或者一份扩增的 cDNA 文库直接置于不含洗涤剂的硝酸纤维素膜或尼龙膜上，复制膜用膜-膜接触的方法制备。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

本方案主要描述了筛选噬菌体 M13 重组克隆，而一种选择方案是筛选含噬菌粒的细菌克隆。最后也介绍了用 PCR 检测突变体的方法。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

这一方法适用于任何大小的细菌克隆，但小的克隆可以给出最清楚的结果。小克隆可以产生尖锐的杂交信号，而且在克隆从琼脂板转到膜的过程中不会弥散。操作中采用能够包含 2500 克隆的 90 mm 板效果最好。在保证没有气泡的情况下，用更大的滤膜很难正好覆盖于 150 mm 板。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。