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- SITE-seq体外脱靶检测及高通量sgRNA筛选
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- 2026年09月27日
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- 文献和实验
- 技术资料
- 提供商：
杭州舒桐生物科技有限公司
- 服务名称：
GUIDE-Seq;SITE-seg
SITE-seq原理如下：提取高分子量DNA，直接进行体外切割，加带有生物素标记的接头，DNA片段化，加上另外一端接头，PCR扩增完成文库构建。最后采用PE150策略进行测序。
SITE-seq原理及实验流程
- 无需高分子量DNA，普通提取的DNA即可；
- DNA需要量少，传统的SITE-seq每个样本至少需要的DNA为10ug，改造后的SITE-Pro仅需5ug就能完成实验；
- 不受物种限制，无论是植物还是动物都可进行检测；
- 可同时检测多条sgRNA的在靶机脱靶，可用于大规模的sgRNA筛选；
- 不仅能检测SpCas9 的脱靶，还能检测SaCas9，AsCpf1和LbCpf1的脱靶；
- 脱靶位点相较于细胞内脱靶检测，其覆盖更加全面；
- 服务周期短，从准备DNA到最终可视化结果呈现，仅需1月。
- 高通量sgRNA筛选：
- 脱靶检测：
- 不仅适用于SpCas9，还适用于SaCas9，AsCpf1和LbCpf1等
| 服务项目 | 内容 | 周期 | 价格 | 交付形式 |
| SITE-Pro | 建库+测序+分析 | 25-35个工作日 | 12000元 | sgRNA质粒（可选）+原始数据+可视化结题报告 |
- DNA样品总量：10ug以上，浓度50ng/ul以上；
- DNA样品纯度：OD260/280=1.8~2.0 ；
- DNA样品完整性：DNA无降解，需提供凝胶电泳检测胶图。
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文献和实验北大伊成器团队 Nature Method 发文，揭示单碱基编辑脱靶风险！
方法，通过尿嘧啶 DNA 糖基酶（Uracil-DNA Glycosylase, UDG）识别 dU 的存在，并以此捕捉被编辑的碱基。图片来源：Nature Method 研究团队对此前未被报道过脱靶现象的，包括 VEGFA_site_2，HEK293_site_4 与 EMX1 在内的几个著名单碱基编辑靶点进行了 Detect-seq，并分别识别出了数十到数百个推测出来的 sgRNA 结合位点，这些位点都表现出了较强的 Detect-seq 信号。去除 CBE 所依赖的 sgRNA，APO 以及 UCI
DNA 会被切割成线性 DNA，而没有酶切位点的环形 DNA 则不会。再对线性的 DNA 进行高通量测序，其与 Digenome-seq 相比，是一种更为灵敏的细胞外检测方法 [3]。CIRCLE-seq 流程示意图3、SITE-Seq在细胞外将 DNA 在 sgRNPs 处理后进行高通量测序，该技术使用了 sgRNA 编程的 Cas9 对基因组 DNA 中的剪切位点序列进行识别 [4]。该方法将生化识别法与细胞活性检测法相结合，具有高精高敏的脱靶位点鉴别能力。细胞内检测方法1、GUIDE-seq
之一。 CIRCLE-seq / CHANGE-seq / SITE-seq：体外或细胞内的无偏检测方法，灵敏度可达 0.1% 级别。 靶向扩增子测序：对预测出的前 10–20 个候选脱靶位点做深度扩增子 NGS，是最容易落地的折中方案，适合多数实验室。 对普通功能研究而言，预测 + top 位点扩增子测序通常已经足够；涉及临床前或治疗性应用时，才需要无偏全基因组方法。 --- 降低脱靶的实用技巧 缩短 spacer 长度：17–18 nt 的 tru-gRNA 可以显著降低脱靶，代价是活性可能略有下降
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