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Hieff NGS® Library Dilution Buffer
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有效期1年
翌圣生物科技(上海)股份有限公司
-20℃保存
50ml
产品名称 |
产品编号 |
规格 |
价格(元) |
Hieff NGS® Library Dilution Buffer |
12303ES50 | 500ml |
485.00 |
Hieff NGS® Library Dilution Buffer是文库稀释液 (10 mM Tris-HCl ,pH 8.0 [25℃],0.05% Tween 20),用于不同种类建库试剂盒最终文库的稀释,请勿使用水或 TE 作为稀释液。稀释后的文库和解冻后的DNA Standards(12307ES09)置于冰上存放,文库应现用现稀释,用完丢弃。本产品可搭配qPCR Master Mix(Cat#12302: 包含定量所需的 qPCR Master Mix、定量扩增引物和参比染料 ROX。扩增引物根据 NGS 文库接头序列 P5 和P7 设计,可保证特异性扩增双端接头完整的文库;qPCR Master Mix 是基于抗体法热启动的染料法 qPCR 预混液。)使用,可对不同长度、不同 GC 或 AT 含量样本高效、特异扩增,实现精确定量。
编号 |
名称 |
规格 |
价格/元 |
12303 |
Library Dilution Buffer |
50 mL |
485 |
冰袋运输。所有组分 -20℃ 保存,有效期 12 个月。
一、关于操作
1.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
2.请于使用前确保产品冻融和彻底混匀,短暂离心收集至管底后置于冰上备用。
3.为保证产品品质,避免反复冻融超过 30 次!
4.为避免样品交叉和气溶胶污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。
5.试剂吸取时应保证枪头适当深入液体,排出时应确认枪头无残留。
6.为避免交叉污染,建议在不同区域分别进行模板制备、体系配制和加模板操作。
二、关于文库稀释
由于 DNA 在非缓冲环境中易降解,因此应使用缓冲稀释液(10 mM Tris-HCl,pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20,对应货号12303ES50)稀释文库,切勿使用水或TE作为稀释液。测定时,文库应现测现稀释,置于冰上待测,切勿使用以往配制储存的稀释文库。
文库需稀释至标准曲线有效 Ct 范围内进行定量,稀释比例可参照过往经验或使用其他测定方式测定的浓度作为参考(如NanoDrop®,Qubit®或 Bioanalyzer)。使用本试剂盒可定量的文库浓度范围参见下表。
DNA Standard |
摩尔浓度 |
质量浓度 |
拷贝数浓度 |
Std 1 |
20 pM |
5.5 pg/μL |
12×10 6 copies/μL |
Std 2 |
2 pM |
0.55 pg/μL |
12×10 5 copies/μL |
Std 3 |
0.2 pM |
0.055 pg/μL |
12×10 4 copies/μL |
Std 4 |
0.02 pM |
0.0055 pg/μL |
12×10 3 copies/μL |
Std 5 |
0.002 pM |
0.00055 pg/μL |
12×10 2 copies/μL |
Std 6 |
0.0002 pM |
0.000055 pg/μL |
12×10 1 copies/μL |
1.进行qPCR 实验时,应保证良好的实验操作规范,以防对工作区域、试剂、耗材、仪器、DNA 标准品等造成污染。推荐将反应体系配制区和模板制备区进行物理隔离,并定时使用 0.5% 次氯-酸钠或 10% 漂白剂对各实验区域进行擦拭清理。
2.反应体系配制过程中DNA Standards 的加入应按照从低浓度至高浓度(DNA Standard 6 至 1)的顺序进行,每次移液都应更换新的枪头,以避免气溶胶污染。
3.每次实验都应平行进行NTC阴性对照反应,配合融解曲线进行扩增特异性和体系污染程度分析。因扩增引物序列为Illumina®平台固定序列而非 qPCR 专用引物序列,且扩增循环数较多,NTC 阴性对照反应出现引物二聚体扩增进而产生 Ct 属正常情况。正常情况下 Ct(NTC)> Ct (DNA Standard 6)+ 3。
一、解冻试剂
将文库稀释液(10 mM Tris-HCl, pH 8.0 + 0.05% Tween 20,对应货号12303ES50),从冰箱中拿出,置于室温 30 min 以上。确保各试剂完全解冻并彻底混匀,短暂离心后置于冰上备用。
二、稀释文库
使用文库稀释液(10 mM Tris-HCl,pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20,对应货号12303ES50)对待测文库进行适当稀释。推荐稀释度为1:10000-1:100000。对于高浓度文库,可额外设置 3 个 2 倍稀释梯度,如按 1:10000 稀释文库,可额外设置 1:20000,1:40000,1:80000 稀释比例,以保证测定值在试剂盒所提供的标曲范围内。
三、反应体系配制
于反应管中配制体系(如下表),上下颠倒或涡旋振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。
名称 |
体积 |
Hieff NGS® SYBR qPCR Master Mix(2×) |
10 μL |
qPCR Primer Mix |
2 μL |
Diluted DNA Library/DNA Standard 1-6/ddH2O* |
4 μL |
ddH2O |
4 μL |
Total |
20 μL |
注:1)每个反应至少设置 3 个平行;2)推荐进行 20 μL 反应体系,如需进行 10 μL 反应,则将体系各组分等比减少;3)*在阴性对照反应管中加入ddH2O;在样品反应管中加入稀释后的文库;在标准曲线反应管中加入DNA Standards;4)根据仪器选择合适的ROX,推荐使用量为 0.5 μL。
四、qPCR 运行程序
将反应管置于 qPCR 仪中,按下述条件(如下表)设置 qPCR 反应程序,并运行(熔解曲线可根据仪器默认即可)。
温度 |
时间 |
循环数 |
95℃ |
5 min |
1 cycle |
95℃ |
30 sec |
35 cycles |
60℃ |
45 sec* |
|
95℃ |
15 sec |
1 cycle |
60℃ |
60 sec |
|
95℃ |
15 sec |
注:*若文库平均长度超过600 bp,应将退火延伸时间由45 sec延长至90 sec。
五、数据分析
1.标准曲线制作
1)根据复孔间 Ct 差异≤0.2 的原则,对 DNA Standards 原始 Ct 进行过滤,并计算平均 Ct。
2)使用有效范围内的 Ct(作为纵坐标)和 Log[pM](作为横坐标)绘制标准曲线。参照 NTC 阴性对照 Ct 确认标准曲线 Ct有效范围。
若 Ct (NTC) > Ct(DNA Standard 6)+ 3,则最大有效 Ct 为 Ct(DNA Standard 6),应使用 DNA Standard 1-6 所产生的 Ct 绘制标准曲线;
若Ct(DNA Standard 6)+ 3 > Ct (NTC) > Ct (DNA Standard 5)+ 3,则最大有效 Ct 为Ct (DNA Standard 5),应使用 DNA Standard 1-5 所产生的 Ct 绘制标准曲线;
若Ct(DNA Standard 5)+ 3 > Ct (NTC)> Ct(DNA Standard 4)+ 3,则最大有效 Ct 为Ct(DNA Standard 4),应使用 DNA Standard 1-4 所产生的 Ct 绘制标准曲线;
基于定量准确性考虑,请至少使用 4 个 Ct(DNA Standards)绘制标准曲线。若 Ct (DNA Standard 4)+ 3 > Ct (NTC),提示定量体系存在严重污染,需更换体系中所有组分后重复试验。
3)绘制的标准曲线相关系数 R2 应不低于 0.99,斜率应位于 -3.1 至 -3.6 之间(表示扩增效率位于 90%-110% 之间)。如标准曲线参数不佳,应重复试验。
2.文库长度矫正
稀释文库的 Ct 只有位于标准曲线有效 Ct 范围之内才可用于浓度计算,同时应对文库进行长度矫正。可根据下述公式计算原始文库浓度(nM):
原始文库浓度(nM)= [450 bp /文库平均长度(bp)] × 稀释文库的浓度(pM)× 稀释倍数/1000
六、使用案例
用 Hieff NGS® DNA Library Quantification Kit for Illumina®定量嗜盐杆菌基因组 DNA 文库,文库 GC 含量为 70%,长度450 bp。将文库稀释 10000 倍上机检测,结果如下图所示。根据标曲及公式,文库终浓度=4.37 pM × 稀释倍数 10000=43.7 nM。
HB210510
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