Hieff NGS®   OnePot Pro PCR-Fr

产品信息

产品名称	产品编号	规格	价格/元
Hieff NGS®   OnePot Pro PCR-Free DNA Library Prep Kit for Illumina®	12209ES08	8 T	1575.00
	12209ES24	24 T	5375.00
	12209ES96	96 T	18875.00

产品描述

Hieff NGS^® OnePot Pro PCR-Free DNA Library Prep Kit for Illumina^®是针对Illumina^®高通量测序平台专业开发设计的新一代酶切法建库试剂盒。与传统的建库法比较，本品采用高质量的片段化酶，摆脱了繁琐的超声过程，同时简化了操作流程，将片段化模块与末端修复模块合二为一，极大的降低了建库的时间和成本。本试剂盒具有优秀的文库转化率，可应用于常规动植物基因组、微生物基因组等样本，同时能兼容FFPE DNA样本的建库。改进版试剂盒使用了最-优化的连接酶，极大的改善了接头连接时的片段自连现象。
 适用500 pg - 1 μg的基因组DNA、全长cDNA等样本
 高质量片段化酶，可随机切割双链DNA，酶切片段无偏好性
 片段化、末端修复/加A一步完成
 适用于FFPE DNA样本
 严格的批次性能与稳定性质控

 

产品组分

组分编号与名称			12209ES08	12209ES24	12209ES96
12209-A		Smearase® Buffer	80 μL	240 μL	960 μL
12209-B		Smearase® Enzyme	40 μL	120 μL	480 μL
12209-C		Ligation Enhancer	240 μL	720 μL	3×960 μL
12209-D		Novel T4 DNA Ligase	40 μL	120 μL	480 μL

运输与保存方法

冰袋运输。所有组分-20°C保存，有效期1年。

 

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；使用专用的移液器等设备；并定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯-钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。
 

二、关于DNA片段化

1. 本试剂盒兼容范围为500 pg - 1 μg Input DNA。应尽可能使用A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0的高质量Input DNA。

2. 若Input DNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐，可能会影响后续实验，建议将DNA稀释在TE（10 mM Tris-HCl ,1 mM EDTA，pH 8.0）中进行片段化。

3. 对于常规的高质量基因组DNA，酶切时间参考表4，本试剂盒片段化偏好低，耐受各种GC含量的模板。对于不同降解程度的FFPE样本，酶切时间参考表5。以上为推荐时间，需客户在自己的实验体系中进行微调，以达到最佳效果。

4.为保证优质精确的片段化效果，片段化反应配制过程请于冰上操作。

5. 针对FFPE DNA建库，若样本质量不佳，客户对当前建库产量不满意，可选购我公司的FFPE DNA Repair Reagent (Cat#12606)对FFPE DNA进行修复，具体使用方法可参考此产品说明书。该试剂可与片段化末修加A过程同时进行，无需额外的操作。
 

三、关于接头连接（Adapter Ligation）

1. 针对Illumina^®测序平台，Yeasen提供48种Barcoded Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4（Cat#12615~Cat#12618）；单端 96种 Index Primers: Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12611~Cat#12612）；双端384 种UDI Primers: Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^®（Cat#12404~Cat#12407）。

2. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer；用量较低可能会影响连接效率及文库产量。表1列举了使用本试剂盒，不同Input DNA量推荐的Adapter使用量。

表1  500 pg-1 μg Input DNA推荐的Adapter使用浓度

Input DNA	Adapter : Input DNA摩尔比	Input DNA	Adapter : Input DNA摩尔比
1 μg	10:1	50 ng	100:1
500 ng	20:1	25 ng	200:1
250 ng	40:1	1 ng	200:1
100 ng	100:1	500 pg	400:1

【注】：Input DNA摩尔数（pmol）≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度（bp）]。

四、关于磁珠纯化与分选（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. DNA片段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前，或接头连接后，或文库扩增后进行。

2. 当Input DNA质量≥50 ng，您可选择在接头连接后分选；如Input DNA质量<50 ng，建议您在文库扩增后进行分选。

3. Ligation Enhancer中包含高浓度的PEG，会对双轮分选产生显著影响。因此，如在接头连接后进行长度分选，必须先进行纯化步骤，再进行双轮分选步骤；如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选，可直接进行双轮磁珠分选步骤。

4. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

6. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

8. 进行长度分选时，初始样品体积应尽量≥100 μL，不足时请用超纯水补齐。以防因样品体积太小导致移液误差增大。

9. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

10. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用TE Buffer洗脱，产物可于4°C可保存1-2周，-20°C可保存1个月。
 

六、关于文库质检（Library Quality Analysis）

1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR绝对定量的方法。

3. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop^®等。

4. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit^®、PicoGreen^®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库干扰。

5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

 

使用方法

一、自备材料

1. 纯化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. DNA质控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。

3. DNA Adapter：Yeasen提供48种Barcoded Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4（Cat#12615~Cat#12618）；单端 96种 Index Primers: Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12611~Cat#12612）；双端384 种UDI Primers: Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^®（Cat#12404~Cat#12407）。或其他等效产品。

4. 其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA ，pH 8.0）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。
 

二、操作流程

图1.OnePot Pro PCR-Free DNA建库试剂盒操作流程

三、操作步骤

3.1 DNA片段化/末端修复/dA尾添加（DNA Fragment/End Preparation/dA-Tailing）

该步骤将基因组DNA片段化，同时进行末端修复及dA尾添加。

1. 将表2中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于冰上配制表2反应体系。

表2.DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应体系

名称	体积（μL）
Input DNA	x
Smearase® Buffer	10
Smearase® Enzyme	5
TE	Up to 60

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述PCR管置于PCR仪，设置表3所示反应程序，进行DNA片段化，末端修复及dA尾添加反应。

表3  DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应程序

温度	时间
热盖105°C	On
4 °C	1 min*
30 °C	3-20 min**
65 °C	20 min
4 °C	Hold

【注】：*DNA片段化过程为有效控制片段化效果，避免过度酶切，反应程序可预先设置4°C，待模块温度降至4°C时，将PCR管放入PCR仪即可。**对于完整的基因组DNA，酶切时间参考表4，Input DNA 500-1000 ng，可根据需求，适当延长酶切时间2-4 min左右；对于质量不一的FFPE DNA样本，酶切时间参考表5。

表4.常规基因组DNA片段化时间选择表表

插入片段主峰大小	片段化时间	优化范围
600 bp	8 min	6-12 min
350 bp	10 min	8-14 min
250 bp	12 min	10-15 min
200 bp	15 min	13-18 min
150 bp	20 min	15-25 min

表5.FFPE DNA片段化时间选择表

插入片段主峰大小	片段化时间	DIN*
250 bp	9-13 min	> 8.0
250 bp	8-11 min	6.5-8.0
250 bp	4-8 min	4.2-6.5
250 bp	3-6 min	2.5-4.2

【注】：*DIN为DNA Integrity Number，是用Agilent 2200来定义FFPE DNA降解程度的一种方法，详见图2。
 

图2.Agilent 2200定义不同降解程度样本的DIN值

3.2 接头连接（Adapter Ligation）

该步骤将3.1步骤的产物末端，连接特定的Illumina^®接头。

1. 根据Input DNA量按表1稀释Adapter至合适浓度。

2. 将表6中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

3. 于3.1步骤PCR管中配制表6所示反应体系。

表6.Adapter Ligation PCR体系

名称	体积（μL）
dA-tailed DNA（3.1步骤产物）	60
Ligation Enhancer	30*
DNA Adapter	5**
Novel T4 DNA Ligase	5

【注】：*Ligation Enhancer比较粘稠，请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。

**本公司接头浓度与常规商业化试剂盒一致，皆为15 μM。
 

【接头添加计算举例】：当Input DNA为100 ng，Input DNA长度为300 bp时，接头应该添加多少？

第一步：计算Input DNA摩尔数。公式：Input DNA摩尔数（pmol）≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度（bp）]；

Input DNA摩尔数（pmol）=100÷（0.66×300）=0.5 pmol；

第二步：计算接头添加摩尔数。根据注意事项三表1查询接头添加比例；

根据表1，查得Input DNA 100 ng时接头添加比例100:1，则接头添加摩尔数=100×0.5 pmol=50 pmol；

第三步：计算接头添加体积。接头浓度=15 μmol/L（如使用其他接头，浓度需要依据其他接头浓度参数）；

接头添加体积=接头添加摩尔数（50 pmol）÷接头浓度（15 μmol/L）=3.34 μL（注：15 μmol/L=15 pmol/μL）

综上，接头可添加3.4 μL，加1.6 μL水补齐至5 μL。（注：接头最大加入体积不超过5 μL）。
 

4. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

5. 将PCR管置于PCR仪中，设置表7所示反应程序，进行接头连接反应。

表7.Adapter Ligation PCR反应程序

温度	时间
热盖105°C	Off
20°C	15 min
4°C	Hold

【注】：当Input DNA量较低，实验效果不理想时，可尝试将连接时间延长一倍。
 

3.3 连接产物磁珠纯化（Post Ligation Clean Up）

该步骤使用磁珠对3.2步骤的产物进行纯化或分选。纯化可除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物。

3.3.1 纯化操作步骤：

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation产物中，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱：

1）如产物无需进行片段分选，直接加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。【注：如纯化产物如需保存，可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，切勿触碰磁珠。

2）如产物需进行双轮分选，加入102 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。【注：如纯化产物如需保存，可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，切勿触碰磁珠。
 

3.3.2 双轮分选操作步骤：

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡约30 min。配制80%乙醇。

2. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

3. 根据DNA片段长度要求，参考表8向上述100 μL DNA上清中加入第一轮分选磁珠，涡旋混匀或移液器吹打10次混匀。

表8.磁珠文库分选推荐比例

DNA文库插入片段大小	150-250   bp	200-300   bp	300-400   bp	400-500   bp	500-600   bp
DNA文库大小	250-350   bp	350-450   bp	450-550   bp	550-650   bp	650-750   bp
第一轮体积比（Beads:DNA）	0.80×	0.70×	0.60×	0.55×	0.50×
第二轮体积比（Beads:DNA）	0.20×	0.20×	0.20×	0.15×	0.15×

【注】：表中“×”表示样品DNA体积。如文库插入片段长度为250 bp，样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.70×100 μL=70 μL；第二轮分选磁珠使用体积为0.20×100 μL=20 μL；表中所推荐比例是针对于Adapter Ligated Insert DNA（Post Ligation），如果用户在接头连接前进行分选，请采用Hieff NGS® DNA Selection Beads（Cat#12601）说明书中推荐的比例。
 

4. 室温孵育5 min。

5. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移上清到干净的离心管中。

6. 参考表8向上清中加入第二轮分选磁珠。

7. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5 min。

8. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

9. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。

10. 重复步骤9。

11. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约5 min）。

12. 将PCR管从磁力架中取出，加入适量21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。

13. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5 min），小心转移20 μL上清至干净的管中。

3.4 文库质量控制

通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项六。

3.5 参考实例

使用Hieff NGS^® OnePot Pro PCR-Free DNA Library Prep Kit for Illumina^®对200 ng Human gDNA (NA12878) 样本进行酶切建库检测，片段化结果见图3。

图3.OnePot Pro PCR Free DNA建库试剂盒酶切200 ng Human gDNA样本（不同酶切时间片段化效果检测）

 

 

HB210203