上海细胞DAPI染色实验

一、DAPI染色的基本原理

1. 分子作用机制
   DAPI通过嵌入DNA双螺旋的小沟区，与AT碱基对形成氢键和π-π堆积作用，结合后荧光强度增强约20倍。其激发波长为358-360 nm，发射波长为460-461 nm，呈现蓝色荧光。尽管DAPI也可与RNA结合（AU序列），但其荧光量子产率仅为DNA结合的20%，且发射波长偏移至500 nm，因此主要作为DNA特异性探针。

2. 染色特异性与优势

   • 高DNA选择性：对细胞核染色专一性强，细胞质背景信号低。
   • 多场景适用：兼容固定细胞和活细胞（需高浓度），适用于荧光显微镜、流式细胞术、染色体分析等。
   • 荧光稳定性：光稳定性优于Hoechst染料，抗淬灭能力较强。

二、实验操作流程

1. 固定与透化处理

• 固定：常用3.7%甲醛固定10分钟，以维持细胞核形态并固定DNA。
• 透化：0.2% Triton X-100处理5分钟，增加细胞膜通透性，促进DAPI进入。

2. DAPI染色步骤

• 稀释工作液：将原液按1:5000比例用PBS稀释至终浓度0.1-1 μg/mL。
• 孵育时间：室温避光染色1-5分钟，活细胞需延长至10-20分钟。
• 清洗与成像：PBS冲洗3次，封片后立即观察以避免荧光衰减。

3. 多色荧光兼容性
DAPI的蓝色荧光与绿色（如FITC）、红色（如Texas Red）染料发射波长重叠较少，适合多重染色实验。

三、试剂配制与储存

四、关键注意事项

1. 安全防护：DAPI具有潜在诱变性，操作时需戴手套并避免直接接触。
2. 荧光淬灭：染色后应尽快检测（推荐当天完成），使用抗淬灭封片剂可延长信号持续时间。
3. 背景控制：避免过度染色，稀释液需精确配制；透化时间过长可能导致核结构破坏。
4. 活细胞染色：DAPI对活细胞膜穿透性有限，需提高浓度（10 μg/mL）或延长孵育时间。