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- 2026年01月20日
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上海达为科生物科技有限公司
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细胞DAPI染色实验
一、DAPI染色的基本原理
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分子作用机制
DAPI通过嵌入DNA双螺旋的小沟区，与AT碱基对形成氢键和π-π堆积作用，结合后荧光强度增强约20倍。其激发波长为358-360 nm，发射波长为460-461 nm，呈现蓝色荧光。尽管DAPI也可与RNA结合（AU序列），但其荧光量子产率仅为DNA结合的20%，且发射波长偏移至500 nm，因此主要作为DNA特异性探针。 -
染色特异性与优势
- 高DNA选择性：对细胞核染色专一性强，细胞质背景信号低。
- 多场景适用：兼容固定细胞和活细胞（需高浓度），适用于荧光显微镜、流式细胞术、染色体分析等。
- 荧光稳定性：光稳定性优于Hoechst染料，抗淬灭能力较强。
二、实验操作流程
1. 固定与透化处理
- 固定：常用3.7%甲醛固定10分钟，以维持细胞核形态并固定DNA。
- 透化：0.2% Triton X-100处理5分钟，增加细胞膜通透性，促进DAPI进入。
2. DAPI染色步骤
- 稀释工作液：将原液按1:5000比例用PBS稀释至终浓度0.1-1 μg/mL。
- 孵育时间：室温避光染色1-5分钟，活细胞需延长至10-20分钟。
- 清洗与成像：PBS冲洗3次，封片后立即观察以避免荧光衰减。
3. 多色荧光兼容性
DAPI的蓝色荧光与绿色（如FITC）、红色（如Texas Red）染料发射波长重叠较少，适合多重染色实验。
三、试剂配制与储存
| 试剂 | 配制方法 | 储存条件 |
|---|---|---|
| DAPI储备液（5 mg/mL） | 1 mg DAPI粉末溶于200 μL去离子水或DMF（需超声助溶） | 避光，-20℃长期保存 |
| DAPI工作液（300 nM） | 取14.3 mM储备液2.1 μL加入100 μL PBS，再稀释至1:1000 | 现用现配，4℃短期保存 |
| PBS缓冲液（pH 7.0） | 0.1 M NaH2PO4·H2O 34 mL + 0.1 M Na2HPO4 66 mL + NaCl 0.9 g，定容至1 L | 4℃保存，避免污染 |
四、关键注意事项
- 安全防护：DAPI具有潜在诱变性，操作时需戴手套并避免直接接触。
- 荧光淬灭：染色后应尽快检测（推荐当天完成），使用抗淬灭封片剂可延长信号持续时间。
- 背景控制：避免过度染色，稀释液需精确配制；透化时间过长可能导致核结构破坏。
- 活细胞染色：DAPI对活细胞膜穿透性有限，需提高浓度（10 μg/mL）或延长孵育时间。
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文献和实验；(2)DAPI工作液室温染色5～20分钟(可根据实验材料的染色结果而定)；(3)PBS漂洗；(4)水溶性封片剂封片，游离细胞也可直接用含DAPI的PBS封片；(5)荧光显微镜观察。结果：正常的细胞核呈强荧光，细胞质无荧光；固定的组织细胞同样处理，亦可得到相似的染色结果。在有支原体污染的细胞质和细胞表面可见孤立的点状荧光，在感染痘苗病毒的细胞质中存在独特的“星状”荧光簇(star-like fluorescent clusters)，腺病毒感染早期胞质中也可出现荧光。
用DAPI进行细胞染色DAPI的配置Stock solution of 1mg/ml in ddH2O; working solution of 0.25mg/ml to 50mg/ml in ddH2O or PGM.1.Place sample on slide.2.Add a few drops working solution.3.Squash and view.Staining � DAPI Staining for Cells:Separately DAPI staining
前一段时间做干细胞的DAPI染色，把自己收集的一些相关资料和自己的经验写在这里，希望能够给做DAPI染色的战友一点帮助。 将培养中的细胞进行DAPI染色，标记细胞核。 DAPI保存：放在4℃保存。 DAPI配制：使用无菌三蒸水溶解，可以将10mgDAPI溶解在10ml水中，使用冻存管分装，每一管1ml，－20℃冻存。使用的时候，先取一管放在4℃。 染色：把培养皿中的培养基换一次液，每一个皿中放4－8ml培养基，使用微量加样器加DAPI到培养皿中。浓度 50ug/ml
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