Protein A 残留检测试剂盒

Protein A ELISA Kit

货号：TD-Bk301
规格：96次检测
保存：2-8℃
有效期：6个月

适用范围

  
此蛋白A检测ELISA试剂盒用来定量检测重组耐碱性等非天然的蛋白A，只能用于科研和生产，不能应用于人或动物疾病的诊断治疗。本试剂盒提供一个样品的酸化处理方法，把蛋白A从IgG产品中分离出来，在人源化单抗浓度高达2mg/mL的情况下，蛋白A的检测限低至78pg/mL以下。

检测原理

此试剂盒采用标记生物素系统的双抗夹心的技术方法。酶标板预包被蛋白A的特异性单克隆抗体，含有蛋白A的样品使用样品稀释液进行稀释，然后酸化液混合使蛋白A从抗体产品中的分离出来，样品和预包被在酶标板上的蛋白A捕获抗体反应。再加入生物素标记的检测抗体反应形成夹心三明治复合物。然后洗涤去除没有参与反应的物质，加入亲和素标记的HRP，短暂孵育后，进行TMB显色，然后加入终止液终止显色反应，在450nm处检测吸光值，OD值和样品含量成正比关系。

需要用到但试剂盒没有提供的东西

 

1. 10-1000μL的移液器，单道和多道
2. 100mL和1000mL的烧杯
3. 去离子水
4. 各种型号离心管
5. 酶标仪（测450nm）
6. 数据处理分析软件

试剂盒组成成分：
 

Component	Product #	Storage
1. Protein A Standard（proteinA蛋白标准品） Recombinant Alkali-tolerant Protein A in a protein matrix with preservative, 50μg/mL, 1x0.1mL	Bk031	2-8°C
2. Biotinylated Antibody（生物素标记的抗体）                                     Biotinylated anti-protein A monoclonal antibody in a protein matrix with preservative, 1x13mL	Bk016	2-8℃
3. Sample Diluent    （样品稀释液）                                     Tris buffered saline with a protein matrix and preservative, 1x30mL	Bk017	2-8℃
4. Denaturing Buffer   （酸化缓冲液）                                Citrate buffer with detergent and preservative, 1x20mL	Bk018	2-8℃
5. 10x Assay Buffer      （10x）洗涤缓冲液                                   phosphate buffer with preservative, 1x30mL	Bk004	2-8℃
6. Streptavidin labeled HRP   亲和素标记的HRP                                  Streptavidin labeled HRP in a protein matrix with preservative, 1x13mL	Bk019	2-8℃
7. TMB Substrate    （TMB显色液）                                     3,3’,5,5’Tetramethylbenzidine, 1x13mL	Bk007	2-8℃
8. Stop Solution        （终止液）                                   2M sulphuric acid, 1x13mL	Bk008	2-8℃
9.Monoclonal anti-Protein A Coated plate of 96 wells（包被proteinA抗体的96孔酶标板）                12x8 well strips in a bag with desiccant	Bk032	2-8℃

试剂准备：

 

1. 本试剂盒使用前请放置室温（20-25度）
2. 洗涤液配制：30mL洗涤液（10x）中加入270mL去离子水，混匀配成300mL工作洗涤液。如果里面有结晶，请溶解混匀再使用
3. 其他试剂不用稀释直接进行使用

样品处理过程：
 

1. 样品如果需要稀释，采用试剂盒内的样品稀释液进行稀释，可以在96孔板或EP管中进行。
2. 确保每个含有样品的孔（管）的体积都是100μL。
3. 另外加入100μL的标准品和质控品到孔里。
4. 每个孔再加入50μL酸化液，吹打混匀，室温孵育10min（使样品中proteinA和抗体酸化分离）。

注意事项：
 

1. 本试剂盒只可用于科研生产，不可用于体外诊断。
2. 终止液是2M的硫酸，避免接触到眼睛、皮肤和衣物。除此之外，本试剂盒中的试剂不会对人体有任何伤害。
3. 高或低的pH值，洗涤剂，尿素，高盐浓度和有机试剂都是ELISA方法的影响因素，pH的影响很大，样品PH值应控制在7.0-7.4。
4. 如果您在使用过程中有任何问题，请联系本公司技术部门。

试剂盒操作步骤：
 

1. 标准品稀释：

       8个离心管标记1#-8#，取990μL样品稀释液加入到1#和2#管中，取500μL样品稀释液加入到3#-8#管中。再取10μL样品标准品加入到1#管中，涡旋混匀后取10μL再加入到2#管中涡旋混匀。然后取2#管500μL液体加入到3#管中涡旋混匀，再取3#管500μL液体至4#管中涡旋混匀，如此直至8#管。

       稀释完全之后 ，2#-8#离心管中protein A标准品的浓度分别为5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156、0.078ng/mL。另外标记一管为0ng/mL，加入样品稀释液。
标准品和样品准备好之后就进入样品处理程序。
 

　　２.在包被有protein A抗体的酶标板中加入100μL/孔的生物素标记的结合抗体。

　　３.再加入25μL酸化处理好的标准品、样品、质控品和空白到合适的孔里，室温孵育1h。

　　４.甩干，洗涤4次之后，加入100μL/孔的亲和素标记HRP，室温孵育10min。

　　５.甩干，洗涤4次之后，加入100μL/孔的TMB显色液，显色10min，加入100μL/孔终止液，然后在450nm处检测吸光值。

数据处理和结果分析：

利用软件（如Curve Expert或ELISA Calc）通过标准品浓度梯度来建立检测标准曲线，把OD值和标准品浓度的对应关系用4参数逻辑拟合或三次多项式线性拟合成标准曲线，然后把检测样品的OD值带入相应曲线方程计算出对应的样品浓度。

典型的标准品检测数据和曲线拟合：
 

标准品浓度（ng/mL）	平行孔OD		平均值	除零OD值
5	2.085	2.096	2.0905	2.063
2.5	1.294	1.272	1.283	1.2555
1.25	0.737	0.743	0.74	0.7125
0.625	0.43	0.436	0.433	0.4055
0.3125	0.227	0.214	0.2205	0.193
0.156	0.142	0.128	0.135	0.1075
0.078	0.088	0.079	0.0835	0.056
0	0.027	0.028	0.0275	-

分析方法指标：
 

1. 精密度：在样品浓度大于0.3ng/mL的时候，检测变异系数小于10%；样品浓度小于0.3ng/mL的时候，检测变异系数略大于10%。
2. 建议检测具体样品的时候，采用添加质控品的方法来考察样品基质效应对检测结果的影响。
3. 本试剂盒的灵敏度为0.05ng/mL。
4. 勾状效应：本试剂盒是双抗夹心一步法，产生勾状效应的浓度为10μg/mL。