TRAP染色实验

一、定义与原理

TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）染色是一种特异性检测破骨细胞的组织化学染色技术。其核心原理基于破骨细胞高表达的TRAP酶活性：在含酒石酸的酸性条件下，TRAP能水解底物萘酚AS-BI磷酸盐，生成的萘酚AS-BI与显色剂（如六偶氮副品红或Fast Red）结合形成不溶性红色沉淀，从而在显微镜下定位破骨细胞。该酶对酒石酸抑制具有抗性，可排除其他酸性磷酸酶的干扰，提高检测特异性。

二、实验步骤（以石蜡切片为例）

1. 样本预处理

   • 脱蜡至水：依次用二甲苯Ⅰ（20分钟）、二甲苯Ⅱ（20分钟）、梯度乙醇（无水乙醇→95%→85%→75%）处理，最后流水冲洗。
   • 固定：使用4%多ju甲醛或TRAP固定液（2-8℃固定30秒至3分钟）。

2. TRAP工作液配制

   • 按比例混合醋酸缓冲液、六偶氮副品红、萘酚AS-BI磷酸盐溶液，过滤后避光保存（需现配现用）。
   • 示例配方：50 μL副品红溶液 + 50 μL亚xiao酸钠溶液 → 加入100 μL AS-BI磷酸盐底物液 → 混合1.8 mL反应缓冲液 → 过滤。

3. 染色与孵育

   • 预孵育：切片在湿盒中37℃纯水孵育2小时，去除内源性磷酸酶干扰。
   • 显色：滴加TRAP工作液，37℃避光反应20-60分钟（时间依样本活性调整）。

4. 复染与脱水

   • 核染色：苏木素染液（1-2分钟）或甲基绿（5-15分钟）复染，分化液处理后再水洗返蓝。
   • 脱水封片：梯度乙醇脱水→二甲苯透明→中性树胶封固。

三、试剂与仪器

仪器：湿盒、37℃温箱、光学显微镜、切片机、滤膜（0.45 μm）

四、结果判读

• 阳性信号：破骨细胞胞浆呈酒红色或紫红色颗粒，细胞核为浅蓝色（苏木素）或绿色（甲基绿）。
• 定量分析：可通过阳性细胞计数或半定量评分（如染色强度分级：0-3分；阳性细胞比例：0-3分）评估破骨细胞活性。
• 特异性验证：需设置阴性对照（如未诱导的RAW264细胞）以排除非特异性染色。