上海细胞侵袭实验

一、核心实验方法及原理对比

1. Transwell实验

• 原理：通过微孔膜（孔径通常为8 μm）分隔上下室，上室细胞在趋化因子梯度诱导下穿过基质胶（如Matrigel）迁移至下室，模拟体内侵袭行为。
• 特点：
  • 灵敏度高：可检测低至10^4细胞量的侵袭差异
  • 定量直观：通过染色计数或荧光标记量化结果
  • 适用性广：适用于肾纤维化模型中的成纤维细胞（如NRK-49F）或肿瘤细胞系

2. Boyden chamber assay

• 历史演变：最初用于白细胞趋化性研究，现改良为高通量版本（如48孔板）。
• 技术差异：
  • 膜材料：常用聚碳酸酯膜，孔径5-12 μm
  • 检测方式：无需基质胶包被时检测迁移，包被后检测侵袭
  • 肾细胞应用案例：Madin-Darby犬肾细胞（MDCK）的极性迁移研究

3. 划痕实验（Wound healing assay）

• 适用场景：
  • 快速评估肾小管上皮细胞（如NRK-52E）的单层修复能力
  • 药物干预对细胞集体迁移的影响（如丹参多酚酸盐抗纤维化研究）
• 局限性：
  • 无法区分主动迁移与增殖效应
  • 对基底膜穿透能力的模拟不足

二、实验操作全流程与关键技术点

1. 前期准备

• 细胞选择与处理：

  • 原代细胞：大鼠肾巨噬细胞需经CD68免疫荧光鉴定纯度>90%
  • 细胞系：NRK-52E需在含10%胎牛血清的DMEM中传代至对数生长期
  • 预处理：血清饥饿（无血清培养基处理6-12小时）以减少增殖干扰

• 基质胶包被优化：

  • 浓度梯度：Matrigel稀释比例1:3至1:8（依细胞侵袭力调整）
  • 固化条件：37℃孵育30分钟形成均质凝胶层，避免气泡产生

2. 实验执行

• 细胞接种：

  • 密度控制：5×10^4至1×10^5细胞/孔（过密导致假阳性，过疏统计误差大）
  • 诱导因子：

• 阳性对照：10% FBS或50 ng/mL HGF（肝细胞生长因子）

• 药物干预：如微囊藻毒素LR（100-1000 nmol/L）诱导肾细胞凋亡

• 培养条件：

  • 时间窗：侵袭实验需24-48小时（迁移实验可缩短至6-12小时）
  • 气体环境：5% CO₂，湿度>90%，避免培养基蒸发导致渗透压变化

3. 结果获取

• 固定与染色：

  • 固定液：4%多ju甲醛（15分钟）优于甲醇，减少细胞脱落
  • 双染策略：0.1%结晶紫（整体细胞）联合DAPI（核定位），区分侵袭与残留细胞

• 图像分析：

  • 软件选择：ImageJ（免费）或Image-Pro Plus（商业版）

  • 定量指标：

  • 动态监测：使用活细胞成像系统（如IncuCyte）实时追踪迁移轨迹