上海细胞爬片免疫荧光实验

一、实验原理与目的

细胞爬片免疫荧光实验通过将细胞培养在经特殊处理的载玻片（爬片）上，利用抗原-抗体特异性结合的原理，结合荧光标记技术，实现细胞内特定蛋白的定位与可视化。该技术广泛应用于细胞生物学研究，如蛋白亚细胞定位、信号转导路径分析等。

二、实验流程

1. 细胞爬片制备

• 载玻片预处理：
  使用常规盖玻片或专用爬片，剪裁至合适尺寸（如6孔板适配的1cm²）。通过浓硫酸浸泡过夜去除有机残留，经蒸馏水冲洗、高压灭菌后烘干备用。为提高细胞贴附性，可涂布多聚赖氨酸（0.1mg/mL，30分钟）。
• 细胞接种：
  消化细胞后计数，重悬于培养基中。预先在培养孔中滴加少量培养基以固定爬片，避免漂浮。接种密度需根据实验需求调整（如24孔板建议0.02×10^6细胞/孔）。
• 培养与固定：
  细胞贴壁后（通常过夜），用4%多ju甲醛（PFA）4℃固定15-30分钟，PBS清洗3次去除残留固定液。

2. 免疫荧光染色

• 透膜处理（可选）：
  针对胞内抗原，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）室温通透20分钟，增强抗体渗透性。膜蛋白检测可省略此步骤。
• 封闭：
  滴加5%-10%正常血清（如山羊血清）室温封闭30-60分钟，阻断非特异性结合位点。
• 一抗孵育：
  稀释一抗（推荐1:100-1:200）于封闭液中，4℃过夜或室温2小时。需设置阴性对照（以PBS代替一抗）。
• 二抗孵育：
  PBS清洗后，加入荧光标记二抗（避光操作），室温孵育1小时。建议二抗稀释液中加入DAPI（1:1000）同步染核。
• 封片与保存：
  使用抗淬灭封片剂（如Fluoromount-G）封固，避光保存于-20℃。若需长期保存，可覆盖指甲油密封边缘。