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- 2026年01月08日
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上海达为科生物科技有限公司
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细胞爬片免疫组化实验
一、实验原理与目的
细胞爬片免疫荧光实验通过将细胞培养在经特殊处理的载玻片（爬片）上，利用抗原-抗体特异性结合的原理，结合荧光标记技术，实现细胞内特定蛋白的定位与可视化。该技术广泛应用于细胞生物学研究，如蛋白亚细胞定位、信号转导路径分析等。
二、实验流程
1. 细胞爬片制备
- 载玻片预处理：
使用常规盖玻片或专用爬片，剪裁至合适尺寸（如6孔板适配的1cm²）。通过浓硫酸浸泡过夜去除有机残留，经蒸馏水冲洗、高压灭菌后烘干备用。为提高细胞贴附性，可涂布多聚赖氨酸（0.1mg/mL，30分钟）。 - 细胞接种：
消化细胞后计数，重悬于培养基中。预先在培养孔中滴加少量培养基以固定爬片，避免漂浮。接种密度需根据实验需求调整（如24孔板建议0.02×10^6细胞/孔）。 - 培养与固定：
细胞贴壁后（通常过夜），用4%多ju甲醛（PFA）4℃固定15-30分钟，PBS清洗3次去除残留固定液。
2. 免疫荧光染色
- 透膜处理（可选）：
针对胞内抗原，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）室温通透20分钟，增强抗体渗透性。膜蛋白检测可省略此步骤。 - 封闭：
滴加5%-10%正常血清（如山羊血清）室温封闭30-60分钟，阻断非特异性结合位点。 - 一抗孵育：
稀释一抗（推荐1:100-1:200）于封闭液中，4℃过夜或室温2小时。需设置阴性对照（以PBS代替一抗）。 - 二抗孵育：
PBS清洗后，加入荧光标记二抗（避光操作），室温孵育1小时。建议二抗稀释液中加入DAPI（1:1000）同步染核。 - 封片与保存：
使用抗淬灭封片剂（如Fluoromount-G）封固，避光保存于-20℃。若需长期保存，可覆盖指甲油密封边缘。
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文献和实验固定和透化 在培养板中将已爬好细胞的盖玻片用 1 × PBS 浸洗 3 次，每次 3 min。 用 4% 的多聚甲醛固定爬片 15 min，1 × PBS 浸洗玻片 3次，每次 3 min。 0.5%Triton X-100(1× PBS 配制 )室温通透细胞 15 min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）, 1 × PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min。 封闭 吸水纸吸干 1 ×PBS，在玻片上滴加 5% 的正常血清（与二抗种属来源一致或相似），室温封闭 1 h
实验流程：多靶点免疫荧光染色的实验操作与普通单标记免疫组化流程相似。试剂盒中的荧光染料可以在HRP酶的作用下将信号共价结合到抗原上，随后即可衔接下一轮单标染色，直至全部标记完成，即可复染DAPI后封片观察。1.脱蜡水合：1）新鲜二甲苯浸片10min,重复3次。2）梯度乙醇浸片，100% 5min；95% 5min；70% 2min。3）灭菌水洗片1min，重复3次。4）10%中性福尔马林浸片10min，灭菌水洗片1min，重复3次。2.微波修复：1)将脱蜡水合后的玻片置于修复杯中，用抗原
于线粒体外膜表面，或者线粒体嵴上，或者仅需观察经处理后线粒体的形态及分布以选择不同的荧光蛋白/荧光有机小分子探针/纳米荧光探针等 （一般来说荧光蛋白比小分子荧光探针体积更大，在超微显像过程中较大小分子荧光探针等更有利于显微结构的染色）。2、减少背景噪声一张清晰的研究图片应当避免过多的干扰光点出现。在免疫荧光实验中，应尽量保证每次 PBS 清洗次数和时间，减少杂质。细胞免疫荧光相比较于组织免疫荧光略有区别，一抗应在孔板内完成孵育步骤，载玻片上孵一抗时免疫组化笔干燥结块脱落会引起再爬片杂光。此外尽量保证
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