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- 2025年12月24日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 提供商：
上海达为科生物科技有限公司
- 服务名称：
细胞爬片免疫荧光实验
一、实验原理与核心价值
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技术本质
- 通过荧光标记抗体特异性结合细胞内抗原，实现蛋白定位可视化（如核转位、细胞器分布）。
- 兼容多重标记（≤4种蛋白同步检测），结合共聚焦显微镜可实现亚细胞结构共定位分析。
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爬片核心作用
- 为细胞提供平面生长基底，避免直接培养皿染色导致的背景干扰。
- 支撑柱设计（专利技术）确保孵育时抗体均匀覆盖，减少用量50%。
二、标准化操作流程（分日详解）
Day 1：细胞爬片制备与固定
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爬片预处理
- 清洗：盖玻片（24×24 mm）用洗洁剂冲洗 → 纯水漂洗3次 → 75%乙醇浸泡10 min 。
- 灭菌：酒精灯烘烤或紫外照射过夜（杀灭RNase/DNase）。
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细胞接种
参数 要求 依据 细胞密度 1-3×10⁴/cm²（如24孔板：2×10⁴/孔） 避免重叠生长影响观察 接种技巧 滴加细胞悬液于爬片中央 → 轻摇培养板“十”字混匀 防局部过密 培养时间 贴壁时间（2-6 h） + 处理时间（依实验设计） 确保细胞伸展不脱落 -
固定与通透
- 固定剂：4%多ju甲醛（PFA），室温15-30 min 。
注意：固定过度导致抗原表位遮蔽
- 通透条件（胞内抗原必需）：
- 0.5% Triton X-100/PBS，室温20 min 。
- 例外：膜蛋白省略此步。
- 洗涤：PBS浸洗3次 × 5 min（去残留试剂）。
Day 2：抗体孵育与染色
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封闭
- 目的：阻断非特异性结合位点。
- 试剂：5-10% BSA或二抗同源血清（如山羊血清）。
- 时间：室温30 min 。
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一抗孵育
关键参数 优化建议 风险控制 稀释比例 按说明书1:50-1:200预试（高表达蛋白取高值） 避免假阴性 孵育方式 正面朝下法：爬片盖在20μL抗体液滴上 省抗体+均匀覆盖 时间/温度 4℃过夜 或 37℃ 1h（快速试剂盒） 提高结合效率 -
二抗孵育
- 洗涤：PBST（0.1% Tween 20）洗3×5 min 。
- 避光操作：荧光二抗（如Alexa Fluor系列）室温孵育50-120 min 。
注意：二抗种属匹配一抗（如兔一抗→抗兔二抗）
- 核染色与封片
- DAPI染色：1 μg/mL，避光10 min → PBS洗4×5 min 。
- 封片技巧：
- 抗淬灭封片剂（如Fluoromount-G）滴于载玻片 → 爬片细胞面朝下覆盖 。
- 轻压排除气泡，指甲油封边防干燥 。
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文献和实验固定和透化 在培养板中将已爬好细胞的盖玻片用 1 × PBS 浸洗 3 次，每次 3 min。 用 4% 的多聚甲醛固定爬片 15 min，1 × PBS 浸洗玻片 3次，每次 3 min。 0.5%Triton X-100(1× PBS 配制 )室温通透细胞 15 min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）, 1 × PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min。 封闭 吸水纸吸干 1 ×PBS，在玻片上滴加 5% 的正常血清（与二抗种属来源一致或相似），室温封闭 1 h
免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光
实验流程：多靶点免疫荧光染色的实验操作与普通单标记免疫组化流程相似。试剂盒中的荧光染料可以在HRP酶的作用下将信号共价结合到抗原上，随后即可衔接下一轮单标染色，直至全部标记完成，即可复染DAPI后封片观察。1.脱蜡水合：1）新鲜二甲苯浸片10min,重复3次。2）梯度乙醇浸片，100% 5min；95% 5min；70% 2min。3）灭菌水洗片1min，重复3次。4）10%中性福尔马林浸片10min，灭菌水洗片1min，重复3次。2.微波修复：1)将脱蜡水合后的玻片置于修复杯中，用抗原
