小鼠肺组织免疫组化实验

一、实验流程概述

小鼠肺组织免疫组化实验的核心流程包括以下步骤：

1. 样本固定与处理：采用4%多ju甲醛固定24小时，或福尔马林固定后梯度脱水、石蜡包埋。
2. 切片制备：石蜡切片厚度通常为5 μm，需在37℃烘箱中烘干以增强组织附着力。
3. 脱蜡与水化：依次使用二甲苯（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）和无水乙醇梯度脱蜡，再经梯度酒精（95%、85%、75%、50%）水化。
4. 抗原修复：采用微波法（柠檬酸钠缓冲液，pH6.0，95-99℃维持15分钟）或高压加热法恢复抗原表位。
5. 内源性酶灭活：3% H₂O₂处理20分钟以消除过氧化物酶活性。
6. 封闭：使用5% BSA或血清封闭非特异性结合位点。
7. 抗体孵育：一抗（如TTF-1、CD68）4℃过夜，二抗（HRP标记）37℃孵育30分钟。
8. 显色与复染：DAB显色后苏木素复染（30秒至5分钟），梯度酒精脱水。
9. 封片与分析：中性树胶封片，显微镜下观察棕褐色阳性信号。

二、小鼠肺组织样本处理关键点

1. 取材与固定：

   • 处死方法：推荐CO₂窒息法，避免颈椎脱臼导致肺组织损伤。
   • 固定液选择：4%多ju甲醛（PLP固定液）可更好地保存抗原活性。
   • 固定时间：4℃固定24小时，避免过度固定导致抗原交联。

2. 脱水与包埋：

   • 梯度酒精（70%-100%）脱水后，石蜡包埋需控制温度（60-65℃）以防组织收缩。

3. 防脱片处理：

   • 使用多聚赖氨酸包被载玻片，烤片时间延长至2小时（65℃）。
   • 抗原修复后缓慢降温，避免热应力导致组织脱落。