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- 2025年07月12日
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上海禾午生物科技有限公司
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慢病毒构建 干扰慢病毒构建
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ul
病毒滴度的测定
滴定法原理：
病毒感染293T细胞48小时后，使用荧光显微镜（10×10倍）观察每个梯度感染的荧光细胞数，并选用荧光细胞数接近50的梯度，即104梯度进行计数，每孔采用2个不同视野进行细胞计数，每个待测腺病毒共得到6个数值，最后计算平均数，按照公式：滴度=（荧光细胞数×每孔的视野数）/（加入病毒液体积×稀释倍数），计算出***-shRNA，***-shRNA，EGFP-NC病毒滴度。每孔的视野数 指24孔板每孔的面积/用于荧光细胞计数的照片对应的贴壁细胞面积，即2cm2/（1.05mm×1.4mm）=136荧光细胞数×每孔的视野数=每孔的荧光细胞总数
慢病毒在细胞水平的使用
什么是MOI？
“MOI”为”multiplicity of infection”的缩写，中文为“感染复数”或“复感染指数”，含义为感染时病毒和细胞数量的比值，即平均每个细胞感染的病毒活性单位数（TU number /cell）。在实验中将某种细胞感染达到80%时的MOI定义为这种细胞的MOI。
MOI与整合事件以及目的基因的表达相关。一定范围内，表达水平和MOI呈正相关。MOI取决于多种因素，如细胞状态，目的基因的大小与性质，细胞的感染效率等。所以，实验前需查阅相关文献，确定慢病毒对目的细胞的亲嗜性、MOI以及在体（in vivo）注射所需病毒量。若无文献支持，可以通过预实验得到合适的MOI。实际上，即使有文献支持，但由于所用细胞代数、细胞状态以及目的基因的差异，实际的MOI和文献报道也会不同，所以要安排预实验以确定所需MO I以及病毒对细胞生长的影响
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文献和实验一、慢病毒包装简介及其用途 慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔
一、慢病毒包装简介及其用途 慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有
（细菌内同源重组AdEasy System）一、目的基因的克隆（以pshuttle-CMV质粒为例）步骤1、选择适当酶切位点，进行酶切连接，将目的片段插入pshuttl-CMV质粒多克隆位点。2、重组质粒鉴定： 酶切鉴定或测序。3、重组质粒扩增，纯化并准备适量含目的基因的穿梭质粒。4、用PmeI单酶切线性化重组穿梭质粒，电泳鉴定质粒完全被切开。5、胶回收线性化质粒，以备共转化使用。二、共转化 1、大肠杆菌BJ5183电转感受态制备 （1）从新鲜琼脂板上挑取单个BJ5183细菌，接种于LB
