双向电泳实验

基于蛋白质的等电点（pI）差异进行分离。在含有载体两性电解质的凝胶中，施加电场后，蛋白质会向其等电点处迁移。当蛋白质处于其等电点时，所带净电荷为零，此时它在电场中的迁移速度减慢直至停止，从而实现了不同 pI 蛋白质的分离。

主要是根据蛋白质分子量的大小进行分离。SDS 是一种阴离子去污剂，它能与蛋白质结合，使蛋白质变性并带有一定的负电荷。在电场中，蛋白质 - SDS 复合物会按照分子量大小迁移，分子量小的蛋白质迁移速度快，反之则慢，最终实现了不同分子量蛋白质的分离。

蛋白质样品：可以是细胞裂解液、组织提取液等。样品中蛋白质的浓度和纯度对实验结果有很大影响，一般要求蛋白质浓度在一定范围内，并且尽量去除杂质。

载体两性电解质（Carrier ampholytes）：用于在等电聚焦电泳中形成稳定的 pH 梯度。

两性电解质（Ampholytes）：有助于稳定 pH 梯度和促进蛋白质的聚焦。

聚丙xi酰胺单体（Acrylamide）：用于制备聚丙xi酰胺凝胶，为电泳提供支持介质。

交联剂（如 N，N' - 亚甲基双丙xi酰胺，Bis - acrylamide）：使聚丙xi酰胺单体交联形成网络结构。

电泳缓冲液：包括用于等电聚焦电泳和 SDS - PAGE 的不同缓冲体系。

染色液和脱色液：用于蛋白质的染色和脱色，常用的染色剂有考马斯亮蓝等。

SDS（十二烷基硫酸钠）：用于蛋白质的变性和带电。

甘油：在电泳体系中起到增加溶液密度和防止电泳凝胶干燥的作用。

巯基乙醇（β - mercaptoethanol）或二硫苏糖醇（DTT）：作为还原剂，用于破坏蛋白质中的二硫键，使蛋白质完全变性。

溴酚蓝：电泳指示剂，用于观察电泳进程。

蛋白质提取：根据实验材料的不同，采用合适的提取方法。例如，对于细胞样品，可以通过裂解细胞来获取蛋白质。通常使用裂解液（如含有去污剂、蛋白酶抑制剂等成分）来破坏细胞膜结构，释放细胞内的蛋白质。

蛋白质定量：使用如 Bradford 法、BCA 法等蛋白质定量方法，准确测定提取的蛋白质浓度。这一步是为了确保在后续电泳中每个样品的蛋白质加载量准确，避免因量的差异而影响电泳结果的比较。

样品缓冲液添加：向蛋白质样品中加入适量的等电聚焦样品缓冲液（含有两性电解质、尿素、巯基乙醇等成分），使蛋白质充分变性并带电，有助于在第一向电泳中的分离。

凝胶制备：将聚丙xi酰胺单体、交联剂、载体两性电解质等按一定比例混合，在特定的模具中制备凝胶。凝胶的 pH 范围应根据待分离蛋白质的等电点范围来选择，常见的 pH 范围有 3 - 10 等。

加样：将处理好的蛋白质样品小心地加载到等电聚焦凝胶的适当位置，一般是在凝胶的凹槽或点样位置。

电泳：在等电聚焦电泳系统中，设置合适的电压和时间进行电泳。起初可以采用较低的电压进行聚焦，随着蛋白质接近其等电点，逐渐增加电压以提高分离效率。在整个电泳过程中，要保持电泳槽内的温度稳定，防止过热导致蛋白质变性和凝胶损坏。电泳结束后，将凝胶从模具中取出。

凝胶制备：同样将聚丙xi酰胺单体、交联剂等混合制备 SDS - PAGE 凝胶。凝胶的浓度可以根据待分离蛋白质的分子量范围来选择，一般 10% - 15% 的凝胶可以用于分离大多数蛋白质。

凝胶条平衡：将第一向电泳后的凝胶条用平衡缓冲液（含有 SDS、甘油、巯基乙醇等）进行平衡，使蛋白质充分变性和结合 SDS，同时使凝胶条能够适应第二向电泳的条件。

加样：将平衡好的凝胶条放置在 SDS - PAGE 凝胶的上样位置，小心地将其固定在凝胶孔内。

电泳：在 SDS - PAGE 电泳系统中，设置合适的电压进行电泳。开始时可以使用较低电压使蛋白质进入凝胶分离胶，然后提高电压以加快分离速度。当溴酚蓝指示剂条带接近凝胶底部时，停止电泳。

染色：将电泳后的凝胶放入染色液（如考马斯亮蓝 R - 250 染色液）中，使蛋白质条带被染色。染色时间根据凝胶大小和染色液浓度等因素而定，一般为数小时到过夜。

脱色：经过染色后，凝胶背景也会呈现颜色，需要用脱色液（含有甲醇、醋酸和水）进行脱色，使蛋白质条带清晰可见。脱色过程需要不断更换脱色液，直到背景脱色完全，蛋白质条带清晰可辨。