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- 2025年12月29日
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上海达为科生物科技有限公司
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脾单核细胞分离实验
脾单核细胞分离实验操作方法：
采用颈椎脱臼法处死小鼠，于75%的酒精中浸泡10-15min；
在无菌超净台内分离脾脏，放入PBS溶液（按照1：50的比例加入双抗）中清洗2遍；
将清洗后的脾脏组织转移至离心管中，加入适量的RMPI-1640培养基，用剪刀将其剪碎成糜状；
将剪碎后的组织经200目的滤网过滤，得到脾细胞悬液；
另取一个离心管，先加入与细胞悬液等量体积的淋巴细胞分离液，之后将细胞悬液轻轻加到离心管的淋巴细胞分离液上层（注意45度倾斜沿管壁滴加，一定要缓慢否则悬液沉下去导致分层界面不明显）；
3000rpm离心10min，离心完毕后吸取中间白膜层即为脾单个核细胞；
3000rpm离心10min，加入RMPI-1640培养基进行洗涤一次；
用红细胞裂解液去除红细胞；3000rpm离心10min，再次用RMPI-1640培养基进行洗涤一次；
洗涤结束后，所得细胞沉淀用RMPI-1640培养基重悬后进行细胞计数。
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文献和实验单核细胞只占末梢血白细胞的3%～5%，比重与淋巴细胞近似，用离心的方法很难将二者分开。而利用贴壁法也很难将两者分开，且有损伤细胞及回收率低等缺点。现可用以下两种方法获得量较多且纯度较高的单核细胞。 1.Colotta方法 [试剂及配制] (1)pH 7.2 PBS液 (2)聚蔗糖-泛影葡胺分层液(D=1.077) (3)10%小牛血清，25mmol/L HEPES RPMI-1640培养液(pH7.2) (4)46% Percoll液。 [操作方法]
起来。 （ 4 ）加入一块小磁铁棒于瓶中，让其吸住铁粉以及附着在铁粉上的细胞。 （ 5 ）倒出悬液，此悬液主要是淋巴细胞，离心，收集。 （ 6 ）在铁粉瓶内倒入一定量的 Hank’s 液，用力振摇后，以强磁铁吸附，几分钟后，倒出液体。 （ 7 ） 2 000r/min 离心液体，管底即为单核细胞。 玻璃板吸附法 将分离的单个核细胞倾于无菌洁净的玻璃平皿内，置 37
单核细胞具有吸附于固相表面的特性，把单个核细胞放于玻璃或塑料平皿内，37℃于孵育一定时间后，吸附于平皿壁上的细胞即为单核细胞，未吸附的细胞即为淋巴细胞。 一、试剂及配制 1. 含5%小牛血清PRMI-1640培养基。 2. Hank’s液。 二、操作方法 1. 含5%小牛血清PRMI-1640培养基将单个核细胞配成细胞悬液，将细胞悬液置于玻璃或塑料平皿内，37℃静置30～60min 。单核细胞即吸附于平皿表面； 2. 吸取非吸附细胞（淋巴细胞），并用Hank’s液
