细胞形态观察技术服务

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细胞形态观察技术服务是达为科生物的基础服务项目之一，由细胞平台经验丰富的实验人员操作完成。

（一）倒置显微镜下直接观察细胞形态

细胞形态变化包括：细胞核、细胞膜和细胞质的改变，即细胞是否有空泡积累和脂质小滴、是否可见细胞膜膨出（鼓泡）、细胞核染色质的变化以及细胞器如线粒体、溶酶体等的变化、细胞脱壁和贴壁、细胞膜表面是否毛糙无光泽、细胞是否裂解为碎片等。通过细胞形态的这些变化，可直观快速地判断细胞毒性。

（二）透射电子显微镜观察

【材料】

1. 2％～3％琼脂糖。

2. 2％～2.5％戊er醛。

3. 1％四氧化*。

4. 0.2M PBS缓冲液。

5．梯度bing酮。分别为50%,70%,90%,100％浓度的bing酮。

【方法】

1．收集对数生长期的培养细胞5x107左右。将细胞连同培养液放入2ml的离心管中，然后用PBS清洗2～3次，1000～1500r/min离心样品5～10分钟，吸去上清液，混匀细胞。

2．沿管壁小心加入2％～2.5％的冷戊er醛，轻轻吹打，使细胞混匀。在4℃的环境中固定30分钟，然后用指弹法将细胞团块弹散，继续用新的固定液固定细胞30分钟。1000r/min离心5分钟，弃上清液。

3．在4℃下用PBS冲洗后放置1～2小时或者过夜，离心后弃上清液。

4．管内加入0.1～0.5m1 37℃的2％～4％的琼脂糖液，混匀并冷却，形成细胞琼脂凝胶预包埋块。

5．离心管中加入少量的PBS或者75％的乙醇，用铝片沿管壁小心地将细胞琼脂糖松动，预包埋块移到含有75％乙醇的青霉素瓶中，一天后换固定液一次。4℃保存。

6．将预包埋块切成1 mm3大小，放到1％四氧化*中4℃固定1～ 2小时。用PBS反复漂洗后放置30分钟或过夜。

7．分别用50%,70%,90%,100％的bing酮脱水一次，每次10～15分钟；然后100％bing酮脱水3次，每次30分钟。

8．浸入稀释包埋剂（bing酮：包埋剂=1:1)中，室温1小时。再放到纯包埋剂中，37℃过夜。然后60℃固定48小时。放置于干燥器中备用。

9．将样品放到电子显微镜进行透视观察。

（三）扫描电子显微镜观察

培养细胞电镜扫描观察非常方便；在观察铁壁细胞时也需要进行消化，制备成细胞悬液后，用Hanks液漂洗1到2次后，除去细胞碎块和血清蛋白，以防妨碍观察。

【材料】

1. 1.5％戊er醛。

2. 0.2M PBS缓冲液。

3. 50%,70%,90%,95%,100％的梯度乙醇。

4. 1％四氧化*（Os04)。

5．bing酮。

【方法】

1．单层细胞盖玻片培养物冷漂洗后，用1.5％戊er醛4℃固定1～2小时。PBS液清洗3次，每次10分钟。

2．在4℃下用1 % OSO4固定1小时，然后用PBS缓冲液清洗3次，每次10分钟。

3．分别用50%,70%,90%,95%,100％的乙醇依次脱水，每个浓度的乙醇脱水2次，每次15分钟。

4. 100％bing酮脱水3次，每次30分钟。

5．将标本在4℃下用bing酮保存。

6．用扫描电子显微镜观察。