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- 2026年01月08日
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- 详细信息
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- 技术资料
- 提供商：
上海达为科生物科技有限公司
- 服务名称：
免疫荧光实验
1. 样本制备
- 细胞固定：
- 培养第7-8天的神经元弃培养基，4%多ju甲醛（PFA）室温固定30分钟（冰冻切片需4℃过夜）。
- 固定后PBS洗涤3次，每次5分钟，去除残留固定剂。
- 透化处理：0.1% Triton X-100/PBS溶液室温透化10分钟，增加抗体渗透性。
2. 封闭与抗体孵育
- 封闭：10%山羊血清/PBS封闭1小时（37℃），阻断非特异性结合位点。
- 一抗孵育：
- 稀释比例：根据抗体说明书优化（如MAP2 1:200，NeuN 1:500）。
- 条件：4℃湿盒过夜，避免干燥。
- 二抗孵育：避光条件下，荧光二抗（1:500-1:1000）室温孵育1小时。
3. 复染与封片
- 核染色：DAPI（1 μg/mL）室温孵育5分钟，标记细胞核。
- 封片：抗淬灭封片剂覆盖组织，避免气泡，4℃避光保存。
4. 图像采集与分析
- 显微镜设置：
- 共聚焦显微镜（如Zeiss LSM 880）用于高分辨率成像，激光功率≤5%防止光漂白。
- 荧光滤光片匹配发射波长（如DAPI：Ex 405 nm，Em 450 nm）。
- 定量分析：
- 软件工具：Image J或Imaris分析荧光强度、共定位系数（Manders系数）。
- 阳性率计算：随机选取5-10个视野（×400），阳性细胞数/总细胞数×100%。
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文献和实验相关实验
固定和透化 在培养板中将已爬好细胞的盖玻片用 1 × PBS 浸洗 3 次，每次 3 min。 用 4% 的多聚甲醛固定爬片 15 min，1 × PBS 浸洗玻片 3次，每次 3 min。 0.5%Triton X-100(1× PBS 配制 )室温通透细胞 15 min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）, 1 × PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min。 封闭 吸水纸吸干 1 ×PBS，在玻片上滴加 5% 的正常血清（与二抗种属来源一致或相似），室温封闭 1 h
实验流程：多靶点免疫荧光染色的实验操作与普通单标记免疫组化流程相似。试剂盒中的荧光染料可以在HRP酶的作用下将信号共价结合到抗原上，随后即可衔接下一轮单标染色，直至全部标记完成，即可复染DAPI后封片观察。1.脱蜡水合：1）新鲜二甲苯浸片10min,重复3次。2）梯度乙醇浸片，100% 5min；95% 5min；70% 2min。3）灭菌水洗片1min，重复3次。4）10%中性福尔马林浸片10min，灭菌水洗片1min，重复3次。2.微波修复：1)将脱蜡水合后的玻片置于修复杯中，用抗原
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