免疫荧光实验技术服务

1. 样本制备

• 细胞固定：
  1. 培养第7-8天的神经元弃培养基，4%多ju甲醛（PFA）室温固定30分钟（冰冻切片需4℃过夜）。
  2. 固定后PBS洗涤3次，每次5分钟，去除残留固定剂。
• 透化处理：0.1% Triton X-100/PBS溶液室温透化10分钟，增加抗体渗透性。

2. 封闭与抗体孵育

• 封闭：10%山羊血清/PBS封闭1小时（37℃），阻断非特异性结合位点。
• 一抗孵育：
  • 稀释比例：根据抗体说明书优化（如MAP2 1:200，NeuN 1:500）。
  • 条件：4℃湿盒过夜，避免干燥。
• 二抗孵育：避光条件下，荧光二抗（1:500-1:1000）室温孵育1小时。

3. 复染与封片

• 核染色：DAPI（1 μg/mL）室温孵育5分钟，标记细胞核。
  
   
• 封片：抗淬灭封片剂覆盖组织，避免气泡，4℃避光保存。

4. 图像采集与分析

• 显微镜设置：
  • 共聚焦显微镜（如Zeiss LSM 880）用于高分辨率成像，激光功率≤5%防止光漂白。
  • 荧光滤光片匹配发射波长（如DAPI：Ex 405 nm，Em 450 nm）。
• 定量分析：
  • 软件工具：Image J或Imaris分析荧光强度、共定位系数（Manders系数）。
  • 阳性率计算：随机选取5-10个视野（×400），阳性细胞数/总细胞数×100%。