柱式法提取植物miRNA试剂盒

本试剂盒采用独特裂解液替代传统Trizol，可以从植物组织中快速提取miRNA，且提取到的miRNA纯度和浓度均高，没有其他杂质污染，可用于RT-qPCR等多种下游实验。
操作步骤：
1.在1.5mL离心管中加入500μL裂解液，液氮中研磨适量新鲜植物组织成细粉后，取50-100mg细粉转入上述装有裂解液的离心管中，涡旋震荡15s，室温静置5min。
2.向上述裂解完毕的液体中加入100μL氯仿，涡旋震荡30s，室温静置5min。
3.4℃，12000rpm离心10min。
4.量取上清液体积，缓慢转移至新的1.5mL离心管，然后向其中加入0.45倍上清液体积的无水乙醇（如：400μL上清液加180μL无水乙醇），涡旋震荡5s。
5.将上述混合物一次性加入吸附柱（吸附柱放在收集管中），12000rpm离心2min，收集滤液。
6.量取滤液体积，缓慢转移至新的1.5mL离心管，然后向其中加入0.65倍滤液体积的无水乙醇（如：500μL滤液加325μL无水乙醇），涡旋震荡5s。
7.将上述混合物一次性或分两次加入新的吸附柱（吸附柱放在收集管中），12000rpm离心2min，弃滤液。
【注】
若滤液体积不超过500μL，混合物可一次性加入吸附柱，反之则需分两次加入。
8.吸附柱重新放回收集管中，然后向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min，弃滤液。
9.重复一遍8。
10.将上一步吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，弃掉收集管，吸附柱开盖放置2min，以除去残留乙醇。
11.将吸附柱放入新的1.5mL离心管中，向吸附柱中央加入30μLRNase-freeddH2O，室温放置5min。4℃，12000rpm离心2min，得到miRNA溶液。
注意事项：
1.所有相关器皿耗材都应为RNase-free产品，操作过程要小心，带口罩、手套避免环境中RNA酶污染样品。
2.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
尽量使用新鲜植物组织提取miRNA。

采用本试剂盒提取的miRNA质量进行检测，样品包括植物根茎叶等组织，为了进一步检测本试剂盒提取的miRNA是否可以特异性的应用于荧光定量PCR，设计了针对绿萝和吊兰叶片的U6通用引物进行验证，通过荧光定量PCR分析发现，其溶解曲线比较整齐，说明是引物特异性扩增；且其融解曲线特异性好并且不同样品的CT值接近，说明本方法能够取得miRNA可以稳定应用于特异性引物的荧光定量PCR检测。