柱式法提取全血miRNA试剂盒

本试剂盒采用独特的裂解液迅速裂解全血（新鲜的抗凝全血样本）分离miRNA和其他物质，经一系列快速的漂洗-离心即可获得高纯度miRNA。提取的miRNA不含大RNA和DNA，可适用于RT-qPCR等多种下游实验。本试剂盒使用一步上柱，操作简单，用时短。
产品特色：
1.完全无毒，无需酚氯仿等有机试剂抽提。
2.适用范围广，可用于多种样品microRNA及总RNA的抽提纯化。
3.操作简单快速，整个过程30min左右完成。
4.纯度好，得率高，可以直接用于各种下游实验。
操作步骤：
1.在1.5mL离心管中依次加入100μL裂解液A、150μL裂解液B、4.5μLβ-巯基乙醇和200μL血液，涡旋震荡5s，室温静置3min。
2.向上述裂解完毕的液体中加入200μL无水乙醇，涡旋震荡20s，室温静置3min。
3.4℃，12000rpm离心3min。
4.缓慢转移400μL上清液至新的1.5mL离心管，加入400μL95%乙醇，涡旋震荡5s。
5.将上述混合物一次性加入吸附柱（吸附柱放在收集管中），12000rpm离心1min，弃滤液。
6.加入300μL漂洗液1，12000rpm离心1min，弃滤液。
7.重复一遍6。
8.加入300μL漂洗液2，12000rpm离心1min，弃滤液。
9.重复一遍8。
10.将吸附柱放入空的收集管中，12000rpm离心2min，弃掉收集管，吸附柱开盖放置2min，以除去残留乙醇。
11.将吸附柱放入新的1.5mL离心管中，向吸附柱中央加入25μLRNase-freeddH2O，室温放置2min，4℃，12000rpm离心2min，得到miRNA溶液。
注意事项：
1.所有相关器皿耗材都应为RNase-free产品，操作过程要小心，带口罩、手套避免环境中RNA酶污染样品。
2.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
3.尽量使用新鲜的血液进行miRNA提取。
4.漂洗液1在4℃放置一段时间会有结晶析出，此时需加热溶解降至室温后再使用。

采用本试剂盒提取的miRNA质量进行检测，样品包括动物全血、血清、血浆，为了进一步检测本试剂盒提取的miRNA是否可以特异性的应用于荧光定量PCR，设计了针对鼠血的U6通用引物进行验证，通过荧光定量PCR分析发现，其溶解曲线比较整齐，说明是引物特异性扩增；且其融解曲线特异性好并且CT值接近，说明本方法能够取miRNA可以稳定应用于特异性引物的荧光定量PCR检测。