Amplite荧光法葡萄糖定量试剂盒

样品实验方案

简要概述

准备并添加葡萄糖标准品和/或测试样品（50μL）
准备并添加葡萄糖分析工作溶液（50μL）
在37°C孵育10-30分钟
在Ex / Em = 540 / 590nm处检测荧光强度

 

溶液配制

1.储备溶液配制

        除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。
1.1Amplite 红色储备液（250X）：
将100μLDMSO（组分E）加入到Amplite Red底物（组分A）的小瓶中。应立即使用原液。任何剩余的溶液应等分并在-20℃重新冷冻。注意：避免反复冻融循环。注意：在硫醇如二硫苏糖醇（DTT）和2-巯 基 乙 醇存在下，Amplite Red底物不稳定。反应中DTT或2-巯 基乙 醇的浓度应不高于10μM。 Amplite Red底物在高pH（> 8.5）下也不稳定。因此，反应应在pH 7-8下进行。建议使用提供的分析缓冲液（pH 7.4）。

1.2辣根过氧化物酶（HRP）储备液（10 U / mL）：
将1mL测定缓冲液（组分B）加入到辣根过氧化物酶（组分C）的小瓶中。注意：未使用的HRP溶液应分为单次使用的等分试样并储存在-20℃。

1.3葡萄糖氧化酶溶液（100 U / mL）：
将1mL测定缓冲液（组分B）加入葡萄糖氧化酶（组分D）的小瓶中。注意：未使用的葡萄糖氧化酶溶液应分为一次性等分试样并储存在-20℃。

1.4葡萄糖原液（800mM）：
将1mL测定缓冲液（组分B）加入葡萄糖小瓶（组分F）中。注意：未使用的葡萄糖溶液应分为单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

2.标准溶液配制

2.1葡萄糖标准溶液配制
通过将适量的800mM葡萄糖储备溶液稀释到测定缓冲液（组分B）中来制备葡萄糖标准品，以产生30μM的葡萄糖浓度。 然后在测定缓冲液（组分B）中进行1：3连续稀释，得到约10,3,1,0.3,0.1和0.03μM连续稀释的葡萄糖标准品。 包括非葡萄糖缓冲液对照作为空白对照。

 

3.工作溶液配制

表1.一个透明底96孔微孔板的分析工作溶液（2X）

组分	容积
Amplite 红色储备液（250x）	20ul
HRP储备液（10 U / mL）	100ul
葡萄糖氧化酶溶液（100 U / mL）	100ul
分析缓冲液	4.78ml
总容积	5ml

 

操作步骤

表2.固体黑色96孔微孔板中葡萄糖标准品和测试样品的布局。

GS =葡萄糖标准品（GS1-GS7）; BL =空白对照; TS =测试样品。

 

BL	BL	TS	TS
GS1	GS1	...	...
GS2	GS2	...	...
GS3	GS3
GS4	GS4
GS5	GS5
GS6	GS6
GS7	GS7

 

表3.每个孔的试剂组成

葡萄糖标准溶液	空白对照	测试样品
连续稀释：50μL	测定缓冲液（化合物B）：50μL	50ul

注意：由于Amplite 红色底物（对非荧光产物）的过氧化，高浓度的葡萄糖（例如测试样品或标准品中的100μM）可能导致荧光信号减少。

 

葡萄糖测定

1.如表2和3中所述，将葡萄糖标准品和含葡萄糖的测试样品加入96孔黑色微孔板中。

2.将50μL葡萄糖测定工作溶液添加到葡萄糖标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（表2），以使总葡萄糖测定体积为100μL/孔。 注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μL测定反应混合物。

3.将反应在37℃孵育10至30分钟，避光。

4.用荧光板读数器在Ex / Em = 530-570nm / 590-600nm（Ex / Em = 540 / 590nm）监测荧光强度。