绝对定量16S rDNA-seq

简介：

菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数可分为3种，分别为5S、16S以及23S rRNA。16S rRNA为核糖体RNA的一个亚基，16S rDNA即编码该亚基的基因。16S rDNA序列包含10个保守区域和9个可变区域，保守区在细菌间差异不大，可变区具有属或种的特异性。对环境样品（如土壤、水源、皮肤、肠道等）的微生物V4可变区进行测序分析，可获得物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等信息，在环境中微生物组成及进化、微生态研究中有重要指导作用。
康测科技研发的KC-Digital-16S rDNA测序产品，可在扩增前对样品中的每一个微生物V4区域添加唯一的UMI标签，在扩增、测序后对数字标签进行计数，可以完全去除PCR扩增的偏好性，实现数字化精确定量。同时还可准确过滤扩增、测序过程产生的错误，大大提高OTU分类的分辨率，实现对细菌株系进行鉴定。有助于对细菌突变频率、菌群组成的变化机制等进行深入研究。


建库原理：

常规16s rDNA测序与康测 digital 16s rDNA测序建库原理图和文库结构图。KC-digital 16s rDNA 测序扩增引物中包含高复杂度的数字标签（UMI），用以区分不同的模板，并跟踪同一模板扩增出的所有分子。


去重与纠错原理：

不同DNA分子带有不同的UMI，同一DNA扩增出的所有分子带有相同的UMI。
（1）基于UMI可以消除扩增、测序引入的假阳性重复，还原真实的菌群结构；
（2）基于UMI可对同一模板的扩增Reads进行align，消除扩增测序引入的突变；


标准分析结果展示：

康测UID-16S rDNA测序相较于普通16S rDNA测序能够鉴定更多的物种：

康测UID-16S rDNA测序去除PCR重复和错误的效果：

UID-16S rDNA测序应用领域：

1. 医学领域：常见疾病与人体微生物的关系；
2. 动物领域：肠道、瘤胃(如产甲烷菌类群)与动物健康/营养消化研究等;
3. 农业领域：根据微生物与植物互作、农业耕作/施肥处理与土壤微生物群落等;
4. 环境领域：雾霾处理、污水治理、石油降解、酸性矿水处理及海洋环境等;
5. 特殊极端环境：极端环境条件下的微生物类群研究。

使不使用UID，16S结果差在哪里？
 

Journal of Medical Microbiology将10种菌按不同比例、不同浓度 混合之后，使用16s rDNA测序进行检测，发现 :
>不同菌等量混合之后， 检测结果菌间含量差异很大;
>同一菌株混合含量梯度增加， 检测结果无规律;
上述结果表明，
普通1 6s rDNA测序研究菌群结构尚可，但跟踪特定菌群含量变化结果非常不准确。


 

Nature Letter使用UMI对DNA进行标记，用 以去除PCR和测序过程中引入的假阳性突变。对 rpoB基因含有特定突变的菌进行梯度稀释，然后使用该方法对不同稀释度样品中该突变的含量进行检测，发现:
>检出量与加入量呈现很好的线性关系;
>最低检出浓度为10-6
上述结果表明，UMI 可以消除序列假阳性变异，并大大提高菌群定量的准确性。