细菌、噬菌体、真菌、藻类基因编辑

【舒桐科技已经成功进行以下菌株的基因编辑】
大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、恶臭假单胞菌、金葡球菌、沙门氏菌、根瘤菌、咽峡炎链球菌、丝状真菌、酿酒酵母、毕赤酵母、乳酸乳球菌、M13噬菌体、T7噬菌体、金葡球菌噬菌体、肺炎克雷伯菌噬菌体、蓝藻、谷氨酸棒状杆菌等多种菌株。

【CRISPR微生物基因组改造】

CRISPR序列由高度保守的重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）组成。其中，间隔序列来源于外源基因。CRISPR序列附近还有一些相关基因，编码一系列Cas蛋白（核酸酶）。该系统最初是从细菌和古细菌中发现的一种适应性免疫系统，可以抵御病毒和质粒DNA的入侵。目前研究最广泛的是II型的CRISPR/Cas9系统，该系统包含两种重要组分：行使核酸内切酶功能的Cas9蛋白；具有导向功能的sgRNA（由tracrRNA和crRNA连接而成）。Cas9由1409个氨基酸组成，包含两个关键的核酸酶结构域（RuvC和HNH）。HNH结构域负责切割与其互补的DNA单链，切割位点位于PAM（protospacer adjacent motifs）序列上游3个核苷酸处。RuvC结构域则负责切割另一条DNA链，切割位点位于PAM序列上游3-8个核苷酸处。在此背景下，舒桐生物推出CRISPR/Cas9方法进行微生物的基因组改造，可在不同类型的细菌中定制化实现目标基因的敲除、大片段缺失、基因整合（过表达）等服务，保证交付阳性突变株。

【微生物基因编辑定制服务】

舒桐科技提供多种微生物的编辑服务，针对特定的菌可以制定一对一方案，完美解决您的实验需求。

技术优势

a、高效定点切割：利用CRISPR/Cas9系统高效切割后的同源修补机制，对单位点的基因编辑效率可达90%以上；

b、复杂位点编辑：对于复杂且编辑困难的位点，引入λRed重组系统进一步提高CRISPR/Cas9切割后的同源修补效率；

c、碱基自由编辑：基于CRISPR/Cas9系统的碱基编辑和引导编辑可实现任意碱基的转换；

d、无痕编辑：靶位点编辑后不留任何抗性或重组位点，同时消除外源质粒；

e、操作简单：构建好CRISPR编辑质粒后通过电转的方法导入至目标菌体内进行基因编辑；

f、靶向性强：CRISPR技术具有靶向性强、脱靶率低等优势，可实现对目标位点的精准编辑；

g、适用范围广：可实现对多种细菌微生物的精准基因编辑服务。

 

【改造方案】

方案一：利用CRISPR/Cas9系统对微生物基因组的改造服务

与传统的λRed同源重组技术相比，CRISPR-Cas9系统可以实现无痕敲除且效率达到90%以上。此外，它可以同时进行多位点编辑，优势显著。

技术流程

方案二：λRed介导的CRISPR/Cas9基因编辑服务

Red同源重组系统由λ噬菌体的3个基因exo、bet和gam组成，分别编码Exo、Beta和Gam蛋白，主要用于双链DNA同源重组。Exo蛋白单亚基分子量为 24 kD，具有双链核酸外切酶活性，可结合在双链DNA (dsDNA)末端，沿双链DNA的5′端向3′端降解DNA，产生3′突出端。Beta蛋白单亚基分子量为29 kD，是一种单链退火蛋白，在Red同源重组过程中起着决定性作用。Gam蛋白是Exo和Beta蛋白的功能辅助蛋白，可与RecBCD核酸外切酶和SbcCD核酸内切酶结合，分别形成RecBCD-Gam和SbcCD-Gam复合物，进而抑制RecBCD和SbcCD的活性，从而防止线性DNA被降解。针对复杂的编辑位点或自身同源重组能力弱的微生物，舒桐生物了推出λRed介导的CRISPR/Cas9基因编辑服务，通过将λ噬菌体的3个基因exo、bet和gam导入至目标菌株当中，提高菌株对Cas9造成的缺口的同源修补效率。

技术流程

方案三：基于CRISPR/Cas9 的精准碱基编辑技术服务

当dCas9或Cas9n与DNA修饰酶融合表达时，可以在不产生DNA双链断裂的情况下实现单碱基水平碱基替换的工具，其在基础研究和基因治疗领域显示出了极大的潜力。碱基编辑器主要有3种类型：胞嘧啶碱基编辑器 cytosine base editor（CBE）、腺嘌呤碱基编辑器adenine base editor（ABE）和糖基化酶碱基编辑器glycosylase base editor（GBE），它们在不需要DNA双链断裂和编辑模板的情况下可分别实现C-to-T，A-to-G和C-to-G的碱基编辑。在此背景下，舒桐生物推出了基于CRISPR/Cas9 的精准碱基编辑技术服务，可以实现基因组靶位点的精准碱基编辑。

方案四：基于CRISPR/Cas9 的精准引导编辑技术服务

单碱基编辑只能实现特定碱基的转换，无法实现所有碱基的转换。而基于CRISPR系统开发的PEs编辑可有效实现所有12种单碱基的自由转换，而且还能有效实现片段的精准插入与删除。研究表明，该系统在人类细胞中可以引进12个点突变，实现范围是PAM上游3 bp到下游29 bp，插入达44 bp，缺失达80 bp，是目前生物医药领域强有力的研究工具。该技术使用与Cas9n 融合的逆转录酶和prime 编辑扩展的gRNA， 即引导编辑向导RNA (prime editing gRNA, pegRNA)，这可使分子剪刀更加稳定和精确。该技术通过在sgRNA 的3′端引入引物结合位点序列(primer binding site, PBS)并将其与Cas9n 断裂的非靶标链结合，逆转录酶根据其携带的RT 模板逆转录出相应的含有目的突变的单链DNA，该细胞通过DNA 修复进一步将目的基因突变引入基因组。在此背景下，舒桐生物推出了基于CRISPR/Cas9 的精准引导编辑技术服务，该技术可以有效地产生精确的碱基置换、插入和缺失等变异，极大地扩大了基因组精准编辑的范围和能力。

技术流程

项目周期：2-3个月

交付标准

① 靶位点PCR及DNA测序鉴定数据

②工程菌株甘油管2支

③ mRNA转录水平数据——过表达

④项目结题报告

 

【Red/ET法微生物基因组改造】

大肠杆菌Rac原噬菌体上的操纵子recE/recT编码的蛋白能够高效地介导体内同源重组的发生，而且来源于大肠杆菌λ噬菌体的Redα/Redβ蛋白与RecE/RecT蛋白有类似的介导同源重组的功能，因此，Redα/Redβ和RecE/RecT重组酶体系合并命名为“Red/ET重组工程”。与体内自然发生的同源重组相比，Red/ET重组系统只需要40–50 bp的同源臂就能实现高效的同源重组，这一点突破了酶切位点和长片段PCR扩增的局限性对传统基因操作技术的限制，通过合成引物的方式将短同源臂加在PCR产物的两端，可以与任意位置的目标序列进行同源重组，同时Red/ET同源重组技术的操作过程在大肠杆菌中完成，极大缩短了构建载体和基因修饰的步骤与时间，基于此，舒桐科技推出Red/ET法进行微生物的基因组改造，可在不同类型的细菌中定制化实现目标基因的敲除、定点突变、基因敲入、过表达等服务。

Red/ET法微生物基因编辑定制服务

舒桐生物提供多种微生物的编辑服务，微生物类型包括多种常见细菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、农杆菌、分歧杆菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌、假单胞杆菌、发光杆菌、伯克氏菌等等。

服务详情 

a、无标记基因敲除：利用λRed重组系统实现高效基因敲除，并消除抗性基因；

b、定点突变：利用λRed重组系统实现高效基因点突变；

c、基因过表达：利用λRed重组系统实现基因组特点位点的基因过表达。

 

技术优势

a、操作简单，只需要40–50 bp的同源臂就能实现高效的同源重组；

b、适用范围广，可以在多种微生物中实现基因编辑；

c、无标记敲除，基因编辑后消除抗性基因。

技术流程

项目周期：2-3个月

交付标准

① 靶位点PCR及DNA测序鉴定数据

②工程菌株甘油管2支

③ mRNA转录水平数据——过表达

④项目结题报告

 

【案例展示】

（一）：粪肠球菌-外源大片段插入
舒桐科技研发团队针对粪肠球菌特性，开发了其SpCas9编辑体系。我们实现了粪肠球菌基因组的外源大片段的插入，1500-3000bp，编辑效率为50%；且该外源大片段包含mCherry序列，使得被编辑菌株能发红色荧光。

图注. 粪肠球菌基因插入的基因组PCR验证电泳图

图注. 基因编辑后粪肠球菌的荧光显微图像

同样，我们也实现了粪肠球菌的基因的大片段删除，效率为80%。

图注. 粪肠球菌基因大片段删除PCR验证电泳图

（二）：金葡菌USA300-敲除基因

图注. 金葡菌基因敲除PCR验证电泳图

测序最终确认对PCR阳性克隆进行DNA测序，结果准确显示靶基因序列已被成功删除，无移码突变，证明基因敲除圆满成功。

图注. 金葡菌基因敲除DNA测序结果