- ¥1500 - 3600
- Affinity Biosciences
- KF003
- 2025年07月15日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
9999
- 英文名：
ECL Western Blotting Substrate (fg-level)
- 保存条件：
4度
- 规格：
100ml/500ml
| 规格： | 100ml | 产品价格： | ¥1500.0 |
|---|---|---|---|
| 规格： | 500ml | 产品价格： | ¥3600.0 |
一、用途：
本试剂是非放射性发光系统，用于检测固定在膜上的蛋白，其敏感性达1-5fg。用X光片可快速地获得永久的硬拷贝结果。所含独特的底物足以维持12小时以上的发光，便于反复曝光操作，免疫印迹膜经抗体脱卸处理后可供再次抗体探查使用。适用于痕量蛋白或核酸检测。特别节省抗体(一抗1:500-1:5000，二抗1:3000-1:10000)。
二、原理：
辣根过氧化酶使试剂中的发光物（Luminol）氧化并发光，而试剂中含有增强剂这使得发光增强了1000倍。在免疫印迹中，将复杂的蛋白混合物经SDS-PAGE分离，并转移到固相膜上（如NC、PVDF）等，用于免疫学检测，经HRP标记的抗体与膜上的蛋白直接（标记一抗）或间接（标记二抗）反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后，Luminol发生氧化降解，并发射波长为428nm的光，此光可经X光胶片(放射自显影片)感光记录下来。
三、使用方法：
1. 印迹膜制备 按常规方法完成SDS-PAGE和电转膜操作，适当的封闭非常重要。可以通过标记一抗或二抗的手段引入HRP，一般采用市售的HRP二抗交联物。仔细地淋洗对于降低背景非常重要，在与HRP交联物温育后，膜片更需仔细洗涤，所有步骤均在室温下完成。
2. 化学发光试剂的配置 在使用前等量混合Ⅰ液和Ⅱ液，混合后尽快使用。将膜片置混合液中于室温下振荡温育2分钟，每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆盖全膜片。
3.蛋白信号显现
1). 用平头镊钳住膜片，垂直置于吸水纸以吸去过量试剂，置膜片于二层保鲜膜之间，小心赶尽气泡。
2). 将膜片吸附蛋白面朝上，置于X光片盒中，于暗室中压上X光片。
3).根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1-60s，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果。显影冲洗。
4). 调节曝光时间，再次曝光显影。
4、膜的重复使用：
配置62.5mM Tris-Hcl,PH6.7,2%SDS, 7ml/100ml的巯基乙醇的溶液，膜放入后，70℃振荡水浴30分钟。再用TBST或PBST缓冲液洗脱，最后用脱脂牛奶封闭。
四、操作注意：
1. 加入一抗后膜不能再干燥；
2. 适当地封闭和洗涤膜片至关重要；
3. 使用前配置化学发光试剂，配置足够覆盖膜片即可，弃去使用过的混合试剂；
4. 使用干净取样头取用每种试剂；
5. 第一张片子建议曝光5s，观察结果后判断最佳曝光时间可1秒至1min不等；
6. 除了放射自显影片曝光和洗片处理外，所有步骤均不必在暗室中操作；
7. 膜片可经适当方法洗脱原有抗体，再次印迹使用，它不像生色物质需要从膜片上清除底物。
8. NaN3能抑制HRP活性，应避免使用NaN3。
五、安全性：
无特殊毒性，按普通化学品处理。如果不慎与眼、皮肤和衣物接触，请立刻用大量清水冲洗。
六、储存：
2-8℃密封避光保存一年。
| 组分 | 规格 |
| Solution Ⅰ | 25ml/50ml/250ml |
| Solution Ⅱ | 25ml/50ml/250ml |
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文献和实验 我最近两个月一直在做 ECL western，非常困难，都快做疯了。但是，功夫不负有心人，最终还是把困难的非特异条带和背景问题解决了。 经过此番，我总结了几条心得与大家分享： 第一条 不要用平底小盒或杂交袋，用可以旋转的杂交管（可以用 50 ml 塑料离心管做成），我刚刚得到了比较结果，效果大不一样。 第二条 膜在 blocking 前先用 stripping buffer 处理一下（当然也在杂交管中进行，注意要通过旋
化学发光法 ECL Kit Amersham 飞克级 化学
过夜具体多长时间算合适，其实没有硬性规定； 二抗孵育的时间不宜过长，一般是室温下摇床孵育 1~2 小时，抗体孵育完成后要清洗干净，特别是二抗孵育完成后，否则可能导致显影结果出现高背景。 6、发光液配置 大部分实验室使用的 ECL 发光液，A 液和 B 液按照 1：1 的比例配置； 发光液要求现用现配，每次根据使用量合理配置用液量； 发光液配置时间过长同样会引起发光效果不好，背景脏或者漆黑一片。
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