革兰氏阳性菌质粒小量提取试剂盒(1～5mL)

本试剂盒用于Gram+细菌质粒提取，一次可处理1～5mL菌液。

试剂盒组成：

组分	50T	100T
RNase A	250μL	500μL
溶菌酶	3mL	5.5mL
溶液Ⅰ	15mL	30mL
溶液Ⅱ	15mL	30mL
溶液Ⅲ	20mL	40mL
漂洗液	15mL	15mL×2
洗脱液	15mL	30mL
吸附柱	50个	100个
收集管	50个	100个

注意：
使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。溶液Ⅰ在使用前先加入RNase A（将试剂盒中提供的RNase A全部加入），混匀，置于2～8℃保存。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

保存：室温保存，复检期一年，其中RNase A，溶菌酶需置于-20℃保存。

注意事项：

• 使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。


• 洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率；洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率。DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。


• 如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用5～10mL过夜培养物，同时按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。


• DNA浓度及纯度检测：得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD₂₆₀处有显著吸收峰，OD₂₆₀值为1相当于大约50μg/ml双链DNA、40μg/ml单链DNA。OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7～1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。

操作步骤：

• 取1～5mL细菌培养物，12000rpm离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。


• 向留有菌体沉淀的离心管中加入200μL溶液Ⅰ(请先检查是否已加入RNase A），使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。再向其中加入50μL溶菌酶，混匀。37℃水浴30min以上（根据菌液量可适当加长水浴时间）。
  注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。如不能确定为何种菌，请按阳性菌处理。


• 向离心管中加入250μL溶液Ⅱ，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解。
  注意：混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过5min，以免质粒受到破坏。


• 向离心管中加入350μL溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min。
  注意：溶液Ⅲ加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。


• 将上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中(如果一次加不完，可分两次吸附)。


• 向吸附柱中加入600μL漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。


• 向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。


• 12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR等。


• 将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50～200μL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心1min，收集质粒DNA溶液。


• （可选）为了增加质粒的回收率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。