嗜肺军团菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法）

嗜肺军团菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法）

嗜肺军团菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法）
◆ 产品说明
致病菌检测系列基于独特的恒温荧光检测技术，可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增，仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化，自动判读结果。本产品用于嗜肺军团菌的检测。检出
限为 103 CFU/ml。
◆ 产品组成（48 测试）
试剂 含量
A-LS-I 1200μL × 1 支
B-I 55μL × 1 支
C-I 1200μL × 1 支
D-I 1200μL × 4 支
NG-I 50μL × 2 支
PG-LS-I 50μL × 1 支
◆ 适用仪器
Dhelix 1610、Dhelix 3210、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308c 等恒温荧光检测仪，ABI 7500，LightCycler480，CFX 96 等荧光 PCR 仪。
◆ 自备耗材和仪器
①灭菌 1.5mL 或 2.0mL 离心管；②灭菌 0.2mL PCR 管或八联管；③冰盒；④移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；⑤离心机；⑥涡旋混匀器；⑦金属浴
◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
1）第一区：试剂准备区。
2）第二区：样本制备区。
3）第三区：模板添加区。
4）第四区：扩增及产物分析区。
★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心 30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。
6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
7. 检出限为 103 CFU/ml 是以 1 ml 103CFU/ml 增菌液离心后收集菌体再提取的细菌基因组 DNA 作为模板。
◆ 样品处理
参照《WS 394-2012 公共场所集中空调通风系统卫生规范》中附录 B，采集集中空调系统冷却水、冷凝水及其形成的沉积物、软泥等样品中的水样并测定嗜肺军团菌。其它洗浴水、温泉水、景观水等样品中的嗜肺军团菌测定请于-20℃条件下保存，有效期 12 个月可参照执行。
取灭菌的 500 ml 铁质布氏漏斗及配套的 0.22 μm 无菌滤纸，安装于真空抽滤装置上；取采集的水样，颠倒混匀，将 200 ml 水样倒入漏斗；打开真空泵进行抽滤，富集菌体于 0.22 μm 滤纸上；取出过滤后的滤纸转移到灭菌塑料离心管内，加入 2 ml 无菌水，用移液器反复冲洗并置于振荡器上充分振荡，使过滤物溶于无菌水。详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。
◆ 实验操作
将试剂完全解冻，各组分离心 30s。
1. 试剂配制（试剂准备区，放置于冰盒中进行）：
若有 N 个待检样品，则参照下表，按照 N+2 个数量计算各组分用量（N 个待检样品+1 个阴性对照+1 个阳性对照），将反应液置于 0.6ml 或者 1.5ml 离心管中，涡旋混匀，离心 30 秒，分装于 0.2ml PCR 管中，并向每管加入 1滴 C-I（约 20μl）。
试剂 使用量
A-LS-I 22×(N+2)μL
B-I 1×(N+2)μL
反应液总体积 23×(N+2)μL
2．模板制备（样本制备区）
1）将菌悬液摇匀稍静止，取菌悬液 1 mL，10000 rpm 离心 3 min，尽量弃净上清液；
2）涡旋混匀 DNA 提取液，向沉淀中加入 100 μL D-I，涡旋混匀，100℃加热 5 min；
3）10000 rpm 离心 3 min，将上清液转移至新的离心管中备用（2 μL 上清用于核酸扩增）。
3．添加模板（模板添加区，放置于冰盒中进行）
在步骤 1 中已含有反应液的 PCR 管中加入 2μL 模板，顺序为 NG-I、待测样品模板、PG-LS-I。涡旋混匀 30s，离心 1min，立即进行扩增反应。
4. 扩增反应（扩增及产物分析区）
①恒温仪器 63℃条件下反应 30min。
②若使用荧光定量 PCR 仪，则荧光基团选择 FAM，淬灭基团选择 None，将 63℃ 15 s，63℃ 45 s 作为一个循环，于 63℃ 45 s 处收集荧光信号，30 个循环。
其他仪器请参照仪器说明书进行设置。
◆ 结果判定
①仪器自动判定结果，若显示“阳性”，则样品中含有嗜肺军团菌；若显示“阴性”，则样品中不含有嗜肺军团菌或含量低于检测限。
②在荧光定量 PCR 仪上，根据有无“S”型扩增曲线判定结果。若有“S”型扩增曲线，则样品中含有嗜肺军团菌；若无“S”型扩增曲线，则样品中不含有嗜肺军团菌或含量低于检测限。
★ NG 反应管结果显示“阴性”，PG 反应管结果显示“阳性”，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。