免疫荧光技术你真的会吗？

一、直接免疫荧光法

（一）基本原理

将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。

（二）试剂与仪器

磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4

荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释

缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制

搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）

有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）

荧光显微镜

玻片架

滤纸

37℃温箱等。

（三）实验步骤

1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。

2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。

3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。

4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：

（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。

（四）注意事项

1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。

2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。

3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。

（1） 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。

（2） 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。

（3） 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。

如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。

4. 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。

二、间接免疫荧光法测抗体

（一）基本原理

染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。

（二）试剂与仪器

磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4

缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。

荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释 。

搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）

有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）

荧光显微镜

玻片架

滤纸

37℃温箱等。

（三）实验步骤

1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。

2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。

3. 取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1-2次，然后按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡 。

4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。

5. 将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。

6. 重复操作3。

7. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。

8. 荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。

（四）注意事项

1. 荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱。

2. 每次试验时 ，需设置以下三种对照：

（1） 阳性对照：阳性血清+荧光标记物

（2） 阴性对照：阴性血清+荧光标记物

（3） 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物

3. 已知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。

4. 所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。

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