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- 2025年07月15日
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外泌体与疾病相关的研究策略
外泌体简介
外泌体(Exosome)是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡，存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、母乳、羊水等多种体液中，并携带有母细胞的多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能，是细胞和细胞间信息传递的重要方式。
图1 外泌体与其他囊泡之间的区别（Pugholm L H et al., BioMed research international, 2015）
外泌体miRNA的主要优势：
（1）外泌体是由活细胞分泌的，代表了活细胞内部的状态与通信信息输出，因此是较好的诊断疾病的生物标志物的载体；
（2）miRNA装入外泌体或微囊泡中，有包膜包被，可保护不被降解，稳定存在于体液中；
（3）外泌体在大部分体液中均存在，可反应人体的正常生理和病理状态。
图2国家自然基金重点资助项目与外泌体结合相关的研究领域
主要研究策略（以探究外泌体与化疗敏感相关性为例）：
- 收集具有差异化疗反应的肿瘤患者的外周血；
- 提取外周血中的外泌体并进行鉴定，提取外泌体内miRNA进行测序分析；
- 分析化疗反应良好与化疗反应不良患者血清外泌体中miRNA的差异表达；
- 通过生物信息学分析差异miRNA的靶基因其在癌症中的转录失调和PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路以及泛素介导的蛋白水解、癌症中的胆碱代谢等通路；
- 寻找外泌体miRNA分子作为不同化疗敏感性的肿瘤的可靠生物标志物，或可提示与治疗反应的关系；
- 优点：与临床信息密切结合，科研成果对临床具有重要指引作用；且具有一定的创新性，发表SCI较为容易。
主要分析内容：
1、外泌体的提取与外泌体miRNA测序分析；
2、数据产出统计和质量评估；reads与参考序列比对；
3、基因表达丰度统计以及基因表达水平分析，差异表达基因筛选；
5、差异miRNA靶基因预测以及靶基因GO富集分析；
6、差异miRNA靶基因Pathway富集分析。
技术参数
- 样本类型：血清、血浆、尿液、细胞培养上清等
- 推荐测序数据量：10M clean reads
- 测序策略：HiSeq SE50
外泌体合作研究项目案例：外泌体在罕见病生物标记物筛查中的应用
与广州某医院进行科研合作，该研究是在完全不用知晓疾病的任何背景信息即可筛选出高灵敏度和高特异性的Exosome miRNA，找到了4种Exosome miRNA作为川崎病的分子标志物，在200多例临床样本及多中心单盲实验中取得了超高的灵敏度和特异性，远远优于其他各种分子标志物。
图3 对11个候选miRNA进行验证分析
延伸阅读：
https://www.biomart.cn/65402/news/2904074.htm
https://www.biomart.cn/65402/news/2901793.htm
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文献和实验分析（NTA）和 WB marker 鉴定。 二、TEM 鉴定外泌体形态： 将提取的外泌体样本置于冰盒中，使用移液枪吸取外泌体样本于铜网上静置 1 min。(用镊子夹铜网要轻，防止铜网夹破)。再将铜网上的外泌体样本吸干，使用移液枪吸取醋酸双氧铀染色液室温染色。随后将染色完成的样本放于灯下烤。样本制好后，观察拍照，保存图片。结果如下： 图一 TEM 鉴定外泌体的形态 从 TEM 结果中可以看出，从肿瘤组织中分离得到的外泌体具有典型的杯托状结构，且数量比较多。 三
从脑组织中分离外泌体的方法。本文主要和大家分享我们从小鼠脑组织中分离外泌体的效果，供大家参考： 一、采用消化+超离法从脑组织中分离外泌体： 将脑组织剪成薄片，放入离心管中加上消化液进行消化，经水浴、反复轻轻上下颠倒，再用移液枪间断缓慢吹吸至消化结束。随后加入培养基于消化液中，混匀，置于冰上。再进行一系列的差速超速离心过程，包括除杂、滤膜过滤、超离等。最后用 PBS 重悬外泌体，用重悬后的外泌体进行下面的透射电镜（TEM）、纳米粒径跟踪分子（NTA）和 marker WB
？ 外泌体鉴定是进一步研究外泌体功能和机制的工作基础。目前的鉴定方法主要包括透射电子显微镜（TEM）进行形态学观察、纳米颗粒追踪分析（NTA）进行粒径和密度分析、用 WB 进行蛋白标志物的鉴定。WB 鉴定包括 CD63、CD9、CD81、TSG101、Hsp70、syntenin1 等。 透射电镜图 纳米颗粒追踪分析 WB 五、如何研究外泌体？ 外泌体的研究方向主要包括以下三个方面： 寻找疾病诊断和预后的分子标志物。 揭示疾病发病机制，从微环境角度解释
